低表達(dá)衰老標(biāo)記蛋白30對(duì)高鈣狀態(tài)下人晶狀體上皮細(xì)胞增殖和氧化的影響

李松蔓，韓子豪，Aint Thu Thu Win，陳 曦，梁 皓

0引言

衰老標(biāo)記蛋白30(senescence marker protein 30，SMP30)，亦稱(chēng)Regucalcin(RGN)，是一種與衰老相關(guān)的鈣調(diào)節(jié)蛋白[1]。研究報(bào)道，SMP30在白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells，LECs)中的含量高于正常人，但其在60歲以上白內(nèi)障患者中的含量低于60歲及以下患者[2]，而SMP30下調(diào)導(dǎo)致人LECs衰老及凋亡程度加劇[3-4]，提示SMP30含量減少可能與白內(nèi)障形成有關(guān)。持續(xù)高鈣導(dǎo)致鈣穩(wěn)態(tài)喪失是白內(nèi)障的關(guān)鍵致病因素[5]，然而，SMP30作為一種鈣調(diào)節(jié)蛋白，其在高鈣/鈣紊亂狀態(tài)下對(duì)人LECs影響的文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究通過(guò)體外構(gòu)建高鈣培養(yǎng)狀態(tài)，模擬發(fā)生白內(nèi)障時(shí)人LECs的病理狀態(tài)，同時(shí)合成人SMP30靶向基因RGN的RNA干擾(RNA interference，RNAi)序列，下調(diào)SMP30在人LECs系SRA01/04中的表達(dá)，研究細(xì)胞增殖、氧化指標(biāo)的改變，探討SMP30在白內(nèi)障形成中的作用。

1材料和方法

1.1材料人LECs系SRA01/04(廣州吉妮歐生物科技公司)，慢病毒包裝細(xì)胞人腎上皮細(xì)胞系293T、病毒包裝輔助質(zhì)粒pHelper1.0質(zhì)粒、pHelper2.0質(zhì)粒(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，青霉素、鏈霉素(美國(guó)Sigma公司),磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS，北京索萊寶科技有限公司)，總RNA提取試劑盒(美國(guó)Axyen公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司，RR047A)，BrdU-Elisa試劑盒(瑞士Roche公司)，總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測(cè)定試劑盒(WST-1法)、氧化型谷胱甘肽/總谷胱甘肽(oxidized glutathione/total glutathione，GSSG/T-GSH)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；細(xì)胞培養(yǎng)超凈臺(tái)(新加坡藝思高科技有限公司)，二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific公司)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)，Real time PCR儀器(Agilent公司)，酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)SRA01/04細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素(pH 7.4)的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，并置于環(huán)境為37℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2和95%空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2構(gòu)建RGN-RNAi慢病毒表達(dá)載體

1.2.2.1設(shè)計(jì)并合成short hairpin RNA(shRNA)引物根據(jù)NCBI Genebank中人RGN基因(NM_152869.3)mRNA序列，遵循RNAi序列設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)3條RNAi靶點(diǎn)序列用于干擾SMP30靶向基因RGN的表達(dá)，同時(shí)以Scramble序列作為陰性對(duì)照，BLAST分析排除其他非特異同源性序列。實(shí)驗(yàn)分組如下：實(shí)驗(yàn)組(RGN表達(dá)干擾組1～3，knock down group 1～3，KD1～3)，陰性對(duì)照組(空載體組，negative control group of knock down，NCKD)，空白對(duì)照組(SRA01/04細(xì)胞組，blank control group，CON)。3條RNAi靶點(diǎn)序列分別為：KD1(RGN-RNAi-1)：ACCTGAAGCTGGTGGAATT；KD2(RGN-RNAi-2)：TGTGAAGTTGCCTGTTGAT；KD3(RGN-RNAi-3)：ACCGCAGAAGTGTTTACAA。Scramble序列(NCKD)為：TTCTCCGAACGTGTCACGT。將上述4段序列分別設(shè)計(jì)合成shRNA寡核苷酸單鏈，每對(duì)由正義鏈和反義鏈組成(表1)，在5’和3’端分別加入Age Ⅰ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，在退火后形成含短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的小片段雙鏈DNA(double-stranded DNA，dsDNA)。

1.2.2.2 RGN-RNAi慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定通過(guò)T4 DNA連接酶，將Age Ⅰ+EcoR Ⅰ雙酶切線性化成功的慢病毒載體GV248(框架結(jié)構(gòu)：hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin)和上述dsDNA混合進(jìn)行連接反應(yīng)。隨后將連接好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌，用含氨芐青霉素培養(yǎng)基選擇陽(yáng)性克隆，對(duì)單菌落進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，最后進(jìn)行菌落PCR及DNA測(cè)序鑒定，驗(yàn)證重組克隆中插入片段序列是否與設(shè)計(jì)的目標(biāo)序列一致。其中，通用引物為：上游5’-CCATGATTCCTTCATATTTGC-3’，下游5’-ATGTCCTTCTGCTGATACTGGG-3’。

1.2.2.3 RGN-RNAi慢病毒顆粒的包裝與質(zhì)檢選擇測(cè)序正確的菌液轉(zhuǎn)接于10mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，通過(guò)天根無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒抽提合格的質(zhì)粒。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的慢病毒包裝細(xì)胞293T細(xì)胞接種于10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中(細(xì)胞密度：5×106個(gè)/15mL)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約24h，待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)用于感染。感染前用無(wú)血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細(xì)胞2h。將提取合格的GV248載體質(zhì)粒20μg、pHelper1.0質(zhì)粒15μg、pHelper2.0質(zhì)粒10μg及相應(yīng)體積的吉?jiǎng)P感染試劑均勻混合，調(diào)整使混合液總體積為1mL，室溫孵育15min。將混合液緩慢滴入293T細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕混勻避免將細(xì)胞吹起，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。6h后移除含感染混合液的培養(yǎng)基，用10mL PBS輕洗培養(yǎng)皿一次，緩慢加入20mL含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48～72h后收集293T細(xì)胞上清液，4℃、4 000g離心10min，0.45μm濾器過(guò)濾、收集上清液，再次4℃、8 000g離心2h，移除液體并保留沉淀，加入吉?jiǎng)P病毒保存液重懸充分溶解沉淀，4 000g高速離心5min，按要求分裝上清。最后對(duì)慢病毒進(jìn)行質(zhì)檢和病毒滴度檢測(cè)。

1.2.3 RGN-RNAi慢病毒感染SRA01/04細(xì)胞

1.2.3.1慢病毒感染細(xì)胞的預(yù)實(shí)驗(yàn)用完全培養(yǎng)基制備密度為2×103個(gè)/每孔的SRA01/04細(xì)胞懸液，取100μL/孔加入96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24h。分別制備含50μg/mL Polybrene(助感染劑)的完全培養(yǎng)基[P(M)]；含50μg/mL Polybrene的感染增強(qiáng)劑(enhanced infection solution，Eni.S.)[P(E)]，各200μL；用Eni.S.將病毒稀釋成三種滴度：1×108、1×107、1×106TU/mL，各50μL。在每孔細(xì)胞融合度為20%～30%時(shí)，根據(jù)表2分別更換培養(yǎng)液和加入病毒液進(jìn)行細(xì)胞感染：A組：常規(guī)培養(yǎng)基+病毒；B組：常規(guī)培養(yǎng)基+病毒+ P(M)；C組：Eni.S.+病毒；D組：Eni.S.+P(E)+病毒。混勻后繼續(xù)培養(yǎng)8～12h，觀察細(xì)胞形態(tài)并更換培養(yǎng)基。在感染約3～4d、細(xì)胞綠色熒光表達(dá)豐度較高、感染效率約80%且細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)，所對(duì)應(yīng)的感染條件及感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)可用于后續(xù)正式感染SRA01/04細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)。由于此慢病毒含有嘌呤霉素抗性基因，故可在感染3～4d后往完全培養(yǎng)基中加入適量嘌呤霉素以篩選目標(biāo)基因穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞。

表1 針對(duì)人RGN基因序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸單鏈

No5 STEMPLOOPSTEMP3 shRNA-KD1-FCcggcaACCTGAAGCTGGTGGAATTCTCGAGAATTCCACCAGCTTCAGGTtgTTTTTgshRNA-KD1-RaattcaaaaacaACCTGAAGCTGGTGGAATTCTCGAGAATTCCACCAGCTTCAGGTtgshRNA-KD2-FCcggacTGTGAAGTTGCCTGTTGATCTCGAGATCAACAGGCAACTTCACAgtTTTTTgshRNA-KD2-RaattcaaaaaacTGTGAAGTTGCCTGTTGATCTCGAGATCAACAGGCAACTTCACAgtshRNA-KD3-FCcggcaACCGCAGAAGTGTTTACAACTCGAGTTGTAAACACTTCTGCGGTtgTTTTTgshRNA-KD3-RaattcaaaaacaACCGCAGAAGTGTTTACAACTCGAGTTGTAAACACTTCTGCGGTtgshRNA-NCKD-FCcggTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTgshRNA-NCKD-RaattcaaaaaTTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAA

表2 感染預(yù)實(shí)驗(yàn)分組和感染條件

組別病毒滴度1×108TU/mL(MOI=100)1×107TU/mL(MOI=10)1×106TU/mL(MOI=1)Control組培養(yǎng)基100μL培養(yǎng)基100μL培養(yǎng)基100μLA組培養(yǎng)基90μL+Virus10μL培養(yǎng)基90μL+Virus10μL培養(yǎng)基90μL+Virus10μLB組培養(yǎng)基80μL+Virus10μL+P(M)10μL培養(yǎng)基80μL+Virus10μL+P(M)10μL培養(yǎng)基80μL+Virus10μL+P(M)10μLC組Eni.S.90μL+Virus10μLEni.S.90μL+Virus10μLEni.S.90μL+Virus10μLD組Eni.S.80μL+Virus10μL+P(E)10μLEni.S.80μL+Virus10μL+P(E)10μLEni.S.80μL+Virus10μL+P(E)10μL

1.2.3.2 RT-PCR篩選干擾效果佳的RGN-RNAi慢病毒載體選取各組適量感染成功的細(xì)胞，常規(guī)消化、離心收集細(xì)胞沉淀，通過(guò)總RNA提取試劑盒收集細(xì)胞內(nèi)RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后用Real time PCR 儀器檢測(cè)各組感染SRA01/04細(xì)胞中相對(duì)RGN mRNA的表達(dá)情況。內(nèi)參基因和目的基因引物由吉?jiǎng)P基因設(shè)計(jì)合成，RGN-F：5’-GGTCGCTAGACCACAAAATCT-3’，RGN-R：5’-CTAAACGAATCACTCTTCCTCC-3’，擴(kuò)增片段大小為210bp；內(nèi)參基因引物為GAPDH-F：5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，GAPDH-R：5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’，擴(kuò)增片段大小為121bp。反應(yīng)體系為20μL。反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性30s，95℃變性15s，60℃復(fù)性延伸30s，進(jìn)行40次循環(huán)；熔解曲線為95℃ 5s，60℃ 60s，95℃ 5s continuous，最后50℃ 30s結(jié)束反應(yīng)。采用2-△△Ct法計(jì)算基因表達(dá)的相對(duì)比值。

1.2.4 RGN-RNAi對(duì)高鈣狀態(tài)下細(xì)胞增殖和氧化應(yīng)激的影響

1.2.4.1構(gòu)建SRA01/04細(xì)胞高鈣培養(yǎng)狀態(tài)參考課題組前期研究結(jié)果[6]，用含15mmol/L CaCl2的完全培養(yǎng)基處理SRA01/04細(xì)胞24h模擬白內(nèi)障形成時(shí)細(xì)胞外高鈣/鈣紊亂的病理狀態(tài)。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，將選用RGN-RNAi干擾效果最佳的實(shí)驗(yàn)組、NCKD組及CON組在此狀態(tài)培養(yǎng)后，進(jìn)行細(xì)胞增殖活力和氧化指標(biāo)的檢測(cè)。

1.2.4.2 BrdU-Elisa法檢測(cè)高鈣狀態(tài)下的細(xì)胞增殖活力按細(xì)胞量2×103個(gè)/孔均勻接種于96孔板，在高鈣培養(yǎng)狀態(tài)下，于細(xì)胞貼壁后第1、4d檢測(cè)細(xì)胞增殖活力。參照BrdU-Elisa試劑盒操作說(shuō)明，用培養(yǎng)基以1∶100稀釋BrdU原液，在檢測(cè)前每孔加入10μL稀釋后的BrdU試劑，作用8h。吸棄上述液體，室溫避光，分別加入FixDenat試劑(200μL/孔)和10% BSA(200μL/孔)進(jìn)行固定及封閉各30min；用Anti-BrdU-POD工作液(200μL/孔)孵育90min。用無(wú)菌雙蒸水按1∶10稀釋washing Buffer，每孔加入200～300μL，洗板3次，待干。隨后在空的細(xì)胞板外盒中加入無(wú)菌雙蒸水，將待測(cè)培養(yǎng)板放入其中，無(wú)菌雙蒸水沒(méi)過(guò)培養(yǎng)孔，待干。室溫避光，加入substrate solution(100μL/孔)作用5～30min，待液體變成藍(lán)色，加入10% H2SO4(50μL/孔)，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)單波長(zhǎng)為450nm時(shí)的OD值。

1.2.4.3高鈣狀態(tài)下細(xì)胞氧化指標(biāo)的檢測(cè)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SOD活性及GSSG/T-GSH水平以反映細(xì)胞抗氧化及氧化水平的變化。SOD活性用總SOD測(cè)定試劑盒(WST-1法)檢測(cè)，細(xì)胞常規(guī)消化、離心收集細(xì)胞沉淀，用500μL PBS輕洗細(xì)胞2次，離心收集細(xì)胞沉淀，加入500μL PBS輕吹勻，在冰水浴下超聲碎解細(xì)胞，將該原液稀釋成梯度濃度樣本待用，用酶標(biāo)儀讀取測(cè)定OD450nm，核酸微量檢測(cè)儀測(cè)定樣本蛋白濃度，計(jì)算SOD活力。GSSG/T-GSH水平用GSSG/T-GSH試劑盒檢測(cè)，細(xì)胞處理步驟同前，加入500μL試劑4(試劑盒自帶)混勻后在冰水浴下超聲碎解細(xì)胞，酶標(biāo)儀測(cè)出OD450nm數(shù)值，計(jì)算GSSG/T-GSH比值。

圖1RGN-RNAi載體陽(yáng)性克隆的PCR鑒定A：RGN-RNAi-1；B：RGN-RAi-2；C：RGN-RNAi-3。1：以ddH2O為空白對(duì)照模板，擬鑒定體系無(wú)污染；2：以未插入靶向基因的空載體為陰性對(duì)照模板，擬證明擴(kuò)增過(guò)程無(wú)假陽(yáng)性現(xiàn)象；3：Marker；4～8：RGN-RNAi轉(zhuǎn)化子鑒定。

圖2RGN-RNAi重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果A：RGN-RNAi-1；B：RGN-RNAi-2；C：RGN-RNAi-3。

2結(jié)果

2.1 RGN-RNAi慢病毒載體的鑒定菌落PCR鑒定結(jié)果顯示，連接入shRNA片段的陽(yáng)性克隆片段大小為542bp，沒(méi)有連接入shRNA片段的空載體克隆片段大小為508bp，結(jié)合PCR電泳圖初步證實(shí)陽(yáng)性克隆的目的基因片段已正確插入GV248慢病毒載體(圖1)。選取連接成功的克隆進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果提示3組慢病毒載體均有已設(shè)計(jì)的目的基因片段，其序列和設(shè)計(jì)的人RGN寡核苷酸序列完全相同(圖2)，再次證實(shí)目的基因片段已插入GV248載體中，重組RGN-RNAi慢病毒載體構(gòu)建成功。

2.2 RGN-RNAi慢病毒包裝與滴度測(cè)定本研究所使用的GV248慢病毒載體攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescence protein，eGFP)基因，是一種廣泛用于細(xì)胞內(nèi)靶蛋白分子定位和功能觀察的報(bào)告基因，故可通過(guò)觀察細(xì)胞內(nèi)GFP的表達(dá)情況分析感染結(jié)果。將攜帶靶向基因的GV248載體質(zhì)粒、病毒包裝輔助質(zhì)粒(pHelper1.0載體質(zhì)粒+pHelper2.0載體質(zhì)粒)同時(shí)感染293T細(xì)胞，收集、濃縮、純化病毒。用熒光法測(cè)定滴度，取10μL濃縮后的病毒采用10倍梯度稀釋后感染293T細(xì)胞，根據(jù)稀釋倍數(shù)及GFP的表達(dá)情況，可見(jiàn)熒光細(xì)胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)的增加而減少，RGN-RNAi-1、RGN-RNAi-2、RGN-RNAi-3三種慢病毒的滴度分別為8×108、1×109、1×109TU/mL，提示均有大量質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，病毒包裝成功(圖3)。

2.3 RGN-RNAi慢病毒感染SRA01/04細(xì)胞預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞貼壁率達(dá)到約20%時(shí)，以MOI=5為基礎(chǔ)，配置含適量的慢病毒及5μg/mL助感染試劑的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)細(xì)胞約16h后更換為普通完全培養(yǎng)基，約72h后熒光顯微鏡觀察可見(jiàn)感染細(xì)胞有GFP表達(dá)，感染效率接近80%，且細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，感染細(xì)胞多次傳代形態(tài)均一且性狀穩(wěn)定，提示細(xì)胞感染成功。后續(xù)實(shí)驗(yàn)以細(xì)胞5×104個(gè)/孔均勻接種于6孔板進(jìn)行正式感染，用于增加每次感染細(xì)胞的數(shù)量，接種體積為2mL/孔，換液體積為1mL/次(圖4)。

2.4 RGN-RNAi對(duì)SRA01/04細(xì)胞RGN基因表達(dá)的影響RGN-RNAi慢病毒以優(yōu)化條件感染SRA01/04細(xì)胞后，收集RNA樣品，應(yīng)用Real time PCR檢測(cè)SMP30靶向基因RGN mRNA表達(dá)水平的變化，結(jié)果顯示，CON組、NCKD組、實(shí)驗(yàn)組(KD1～3)細(xì)胞RGN mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.95±0.08、1.00±0.03、0.07±0.01、0.40±0.06、0.26±0.04，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=191.734，P<0.001；n=3)；CON組和NCKD組細(xì)胞RGN mRNA的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.26)，提示慢病毒空載質(zhì)粒感染對(duì)SMP30靶向基因RGN的表達(dá)無(wú)特異性的影響；與NCKD組相比，實(shí)驗(yàn)組(KD1～3)細(xì)胞RGN mRNA水平均有不同程度降低(均P<0.001)，實(shí)驗(yàn)組(KD1～3)的敲減效率分別為93%、60%、74%，故選擇干擾效果最佳的KD1組shRNA片段進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3RGN-RNAi慢病毒感染293T細(xì)胞后的滴度測(cè)定熒光圖(×100)A：1μL病毒原液；B：0.1μL病毒原液；C：0.01μL病毒原液；D：0.001μL病毒原液。

圖4RGN-RNAi慢病毒感染SRA01/04細(xì)胞(×100)A：光學(xué)顯微鏡下觀察；B：熒光顯微鏡下觀察。

2.5 RGN-RNAi對(duì)高鈣狀態(tài)下SRA01/04細(xì)胞增殖的影響本研究以第4d與第1d OD450nm的比值(ODday4/ODday1)表示各組細(xì)胞的相對(duì)增殖活力。Brdu-Elisa檢測(cè)結(jié)果顯示，高鈣狀態(tài)下，CON組、NCKD組、實(shí)驗(yàn)組(KD1)細(xì)胞相對(duì)增殖活力分別為2.96±0.25、2.95±0.08、2.42±0.08，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.37，P=0.01；n=3)；實(shí)驗(yàn)組(KD1)細(xì)胞相對(duì)增殖活力低于CON組和NCKD組(均P=0.01)，但CON組和NCKD組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.97)。

2.6 RGN-RNAi對(duì)高鈣狀態(tài)下SRA01/04細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響SOD活性檢測(cè)結(jié)果顯示，高鈣狀態(tài)下，CON組、NCKD組、實(shí)驗(yàn)組(KD1)細(xì)胞SOD活力分別為26.33±1.04、31.10±2.24、11.69±0.52U/mg，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=57.81，P=0.01；n=3)；實(shí)驗(yàn)組(KD1)細(xì)胞SOD活力低于CON組和NCKD組(均P<0.001)，但CON組和NCKD組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.07)。

GSSG/T-GSH水平檢測(cè)結(jié)果顯示，高鈣狀態(tài)下，CON組、NCKD組、實(shí)驗(yàn)組(KD1)細(xì)胞GSSG/T-GSH水平分別為20.05±2.45、15.93±3.47、70.80±2.34，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=357.63，P<0.001；n=3)；實(shí)驗(yàn)組(KD1)細(xì)胞GSSG/T-GSH水平高于CON組和NCKD組(均P<0.001)，但CON組和NCKD組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.12)。

3討論

SMP30基因定位于X染色體的11.3～11.23區(qū)域，由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成，有研究發(fā)現(xiàn)，SMP30與一種編碼Regucalcin蛋白的cDNA相同，兩者均隨機(jī)體衰老而逐漸減少，不受性別因素影響，故認(rèn)為兩者為同一種蛋白，其靶向基因符號(hào)為RGN。SMP30每分子蛋白質(zhì)存在6～7個(gè)Ca2+高親和結(jié)合位點(diǎn)，其在肝、腎等組織細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激、凋亡等方面發(fā)揮調(diào)控作用，故SMP30是一種具備多重保護(hù)作用的鈣結(jié)合蛋白及鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，提示其在機(jī)體內(nèi)的表達(dá)水平可能與衰老相關(guān)性疾病的分期相關(guān)，SMP30或許可作為機(jī)體衰老、疾病發(fā)生和進(jìn)展的潛在性標(biāo)記物[7-10]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，SMP30與白內(nèi)障密切相關(guān)。在臨床研究中，SMP30在年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜周邊部的LECs表達(dá)強(qiáng)，中央部表達(dá)弱，SMP30低表達(dá)區(qū)域出現(xiàn)人LECs衰老及凋亡程度加劇[3-4]。在體外正常培養(yǎng)狀態(tài)下，下調(diào)SMP30可使人LECs系SRA01/04細(xì)胞增殖活性下降、凋亡率增加[11]。動(dòng)物模型研究，在紫外線B照射誘導(dǎo)下，SMP30基因敲除小鼠由于內(nèi)源性維生素C生成障礙而較野生型小鼠及維生素C喂養(yǎng)型KO小鼠更易出現(xiàn)晶狀體混濁[12]。提示SMP30可能是LECs內(nèi)的一種保護(hù)性蛋白，其含量下降可能誘導(dǎo)/加速白內(nèi)障的形成。

RNAi是一種廣泛應(yīng)用于基因功能研究的基因阻斷技術(shù)，構(gòu)建shRNA載體是目前RNAi最常用的方法之一，慢病毒載體能夠產(chǎn)生表達(dá)高滴度shRNA的慢病毒，通過(guò)慢病毒載體介導(dǎo)RNAi，即結(jié)合慢病毒載體高效、整合的優(yōu)點(diǎn)與RNAi的特性，可長(zhǎng)期、穩(wěn)定地抑制靶向基因的表達(dá)，并傳代到子代細(xì)胞中，是構(gòu)建理想的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型的常見(jiàn)技術(shù)，其在白內(nèi)障基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用也愈加廣泛[13-14]。故本研究以慢病毒為載體，利用shRNA抑制人SMP30靶向基因RGN的表達(dá)，最終成功構(gòu)建干擾SMP30表達(dá)效果佳、感染SRA01/04效率高的shRNA慢病毒載體，以SMP30低表達(dá)人LECs系SRA01/04細(xì)胞為基礎(chǔ)開(kāi)展系列研究。

關(guān)于白內(nèi)障病因?qū)W的基礎(chǔ)研究表明，持續(xù)高鈣和氧化損傷狀態(tài)是白內(nèi)障重要的發(fā)病因素。既往國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)含高濃度Ca2+的培養(yǎng)液培養(yǎng)透明晶狀體和LECs發(fā)現(xiàn)，晶狀體混濁與體外Ca2+濃度的增加相關(guān)，細(xì)胞外異常的高鈣濃度可使LECs鈣穩(wěn)態(tài)喪失，最終導(dǎo)致白內(nèi)障[15-16]。此外，Ca2+超載又可破壞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等鈣、氧化調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，加聚鈣紊亂及氧化應(yīng)激程度，并形成惡性循環(huán)[17-18]。SOD活力和GSSG/T-GSH水平能間接反映細(xì)胞抗氧化損傷能力和氧化應(yīng)激程度。故本研究結(jié)合前期研究結(jié)果，選用15mmol/L CaCl2配制高鈣培養(yǎng)基，培養(yǎng)SRA01/04細(xì)胞24h，通過(guò)體外構(gòu)建高鈣培養(yǎng)狀態(tài)，用于模擬白內(nèi)障形成過(guò)程中人LECs出現(xiàn)高鈣/鈣紊亂的病理狀態(tài)。我們發(fā)現(xiàn)，在高鈣培養(yǎng)狀態(tài)下，下調(diào)SMP30的表達(dá)，可導(dǎo)致SRA01/04細(xì)胞增殖活力及抗氧化能力減弱，細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激程度加劇。有文獻(xiàn)報(bào)道，SMP30/Regucalcin作為一種鈣調(diào)節(jié)蛋白，可通過(guò)增加細(xì)胞肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶(SERCA)活性、線粒體Ca2+-ATP酶活性和ATP依賴(lài)性Ca2+攝取加速肌質(zhì)網(wǎng)和線粒體中Ca2+的攝取，以維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)和增加細(xì)胞存活率的作用[19-21]。由此我們分析，在高鈣誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的狀態(tài)下，SMP30在SRA01/04細(xì)胞中可能也具有調(diào)節(jié)Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的酶活性、維持細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)的作用，當(dāng)SMP30含量減少，其對(duì)SRA01/04細(xì)胞的保護(hù)作用減弱，使細(xì)胞易處于各種損傷因素所致的Ca2+異常波動(dòng)的環(huán)境，加劇細(xì)胞內(nèi)鈣紊亂及氧化損傷的程度，導(dǎo)致細(xì)胞增殖活力下降或細(xì)胞死亡，最終誘導(dǎo)白內(nèi)障的形成或發(fā)展。

綜上所述，高鈣培養(yǎng)狀態(tài)下，shRNA慢病毒載體介導(dǎo)的SMP30低表達(dá)SRA01/04(人LECs)細(xì)胞增殖活力及抗氧化應(yīng)激能力減弱，提示增加細(xì)胞外Ca2+濃度模擬人LECs在白內(nèi)障形成的病理狀態(tài)條件，SMP30的存在可能在一定程度上延緩了SRA01/04細(xì)胞應(yīng)激損傷進(jìn)程，具有調(diào)控細(xì)胞增殖和抗氧化損傷的保護(hù)作用。雖已有研究報(bào)道高表達(dá)SMP30在人LECs系中具有增加細(xì)胞生存率、抗凋亡、抑制活性氧、延緩紫外線損傷等作用[11，22]，但本實(shí)驗(yàn)從另一角度開(kāi)展低表達(dá)SMP30對(duì)人LECs作用的初步研究，為未來(lái)探索SMP30在人LECs和晶狀體中的作用提供了新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。然而，關(guān)于SMP30在人LECs內(nèi)可能參與鈣調(diào)控信號(hào)通路的具體機(jī)制等內(nèi)容尚未明確，有待后期進(jìn)一步研究。