苦酸通調(diào)方對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型中IRS-1、PI3K、Akt蛋白表達(dá)的影響

閆冠池 王秀閣 王國(guó)強(qiáng) 朱浩宇 米佳

(1長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117；2長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 )

糖尿病是以靶器官、靶組織胰島素作用障礙和胰島β細(xì)胞衰竭為病理表現(xiàn)，以血糖水平升高為特征的代謝性疾病〔1〕。國(guó)際糖尿病聯(lián)盟公布最新的“IDF糖尿病地圖”中，全球約4.25億成人患有糖尿病，中國(guó)糖尿病患病人數(shù)達(dá)到1.144億，居全球首位〔2〕。胰島素抵抗(IR)是2型糖尿病的始動(dòng)因素，且貫穿于整個(gè)病程，因此改善IR是治療2型糖尿病及延緩并發(fā)癥的重要策略〔3〕。肝臟為胰島素作用的重要外周靶器官和維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)與平衡的調(diào)控器官。肝細(xì)胞發(fā)生IR時(shí)的病理表現(xiàn)為非糖物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程增強(qiáng)、肝糖原累積減少且消耗增加等。

苦酸通調(diào)方在臨床實(shí)踐和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中具有改善糖脂代謝作用〔4,5〕，其中主要藥物黃連、丹參、大黃等具有改善增加靶器官胰島素敏感性、減輕炎癥反應(yīng)等作用，可用于改善大鼠2型糖尿病模型的糖脂代謝〔6～9〕。此外，大黃與黃連的復(fù)方制劑較單藥應(yīng)用，對(duì)2型糖尿病大鼠的糖代謝情況改善更顯著〔10〕。肝細(xì)胞通過肝糖原的合成、分解與利用參與葡萄糖攝取與儲(chǔ)存平衡，當(dāng)肝糖原合成障礙，血糖升高使IR進(jìn)一步加劇〔11〕。但苦酸通調(diào)方對(duì)IR狀態(tài)下肝糖原合成影響的具體機(jī)制研究尚未充分，故本研究中借助HepG2細(xì)胞IR模型，觀察苦酸通調(diào)方對(duì)該細(xì)胞模型內(nèi)糖原含量及胰島素受體底物(IRS)-1、磷脂酰肌醇3(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)蛋白的表達(dá)，探討苦酸通調(diào)方改善2型糖尿病IR的信號(hào)通路相關(guān)機(jī)制。

1 材料、儀器與方法

1.1細(xì)胞株 HepG2細(xì)胞人肝癌細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2藥物及試劑 苦酸通調(diào)方(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥房提供)；二甲雙胍(HY-17471A，MCE公司)；DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS，12100061、16140071，Gibco公司)；細(xì)胞裂解液、噻唑藍(lán)(MTT)細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(P0013、C0201，武漢碧云天生物公司)；重組人胰島素(S31559，上海源葉生物科技有限公司)；肝/肌糖原測(cè)定試劑盒(A043，南京建成生物工程研究所)；兔抗人單克隆抗體PI3K，單克隆抗體p-PI3K(Thy458)，多克隆抗體Akt，單克隆抗體p-Akt(Ser473)，單克隆抗體p-IRS-1(Ser612)(美國(guó)Cell Signaling公司，批號(hào)分別為4249，9272，4691，5831，50081，3203)；小鼠單克隆抗體IRS-1(美國(guó)Santa Cruz公司，sc-8038)；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔多克隆抗體IgG(BA1054)，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠單克隆抗體IgG(BA1050，武漢博士德生物工程有限公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(A0216，碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.3儀器 濕化型CO2恒溫培養(yǎng)箱(3111，Thermo)；YZ-875超凈工作臺(tái)(江蘇蘇州凈化設(shè)備廠)；低溫高速離心機(jī)(5804R，德國(guó)Eppendorf)；DK-S2微型振蕩器(浙江金華實(shí)驗(yàn)儀器廠)；鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅醫(yī)療生物儀器公司)；M200 PRO酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；超低溫冰箱(900，美國(guó)Thermo Fisher)。

1.4細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞培養(yǎng)在37℃，5%CO2濕化條件中，給予10% FBS、青霉素100 U/ml和鏈霉素100 μg/ml的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度約80%時(shí)進(jìn)行消化傳代。無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h，使各分組細(xì)胞同步化后再進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.5MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性 將MTT溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)為5 mg/ml過濾除菌后備用，選擇細(xì)胞融合度約80%的HepG2細(xì)胞，胰酶消化后，以8 000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24 h，吸棄原培養(yǎng)基，加入不同的干預(yù)液100 μl，培養(yǎng)24 h，每孔加入MTT溶液10 μl，置細(xì)胞于培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育4 h。震蕩混勻，490 nm處測(cè)定吸光度。以空白對(duì)照組細(xì)胞的存活率為100%計(jì)算不同組別細(xì)胞存活率。模型組與空白對(duì)照組不做處理，苦酸通調(diào)方50、100、200 μg/ml為低、中、高劑量組。陽(yáng)性對(duì)照組為二甲雙胍200 μg/ml。

1.6高糖聯(lián)合棕櫚酸孵育建立HepG2 IR模型 稱取19.23 mg棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品溶于0.5 ml無(wú)水乙醇中，將溶解后的棕櫚酸加入24.5 ml高糖DMEM培養(yǎng)〔其中含有0.24 ml胎牛血清，0.5 g 牛血清白蛋白(BSA)〕，55℃水浴15 min，冷卻后過濾除菌即3 mmol/L棕櫚酸溶液，造模時(shí)稀釋至0.25 mmol/L，孵育細(xì)胞24 h，建立HepG2 IR模型。

1.7分組及處理 空白對(duì)照組加入正常培養(yǎng)液，模型組及低、中、高劑量組均加入造模液，孵育24 h，建立IR模型。吸棄培養(yǎng)液，空白對(duì)照組、模型組加入DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液，低、中、高劑量組加入藥物溶液(50、100、200 μg/ml)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h。

1.8細(xì)胞葡萄糖消耗量的檢測(cè) 收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，2 000 r/min離心10 min，吸取上清。苯酚硫酸法分別檢測(cè)上清液及無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖的含量，兩者對(duì)比計(jì)算細(xì)胞葡萄糖的消耗量。此外，考慮苦酸通調(diào)方水溶液呈微黃色液體，藥液的顏色可能干擾定量檢測(cè)，因此另設(shè)藥液空白對(duì)照組，以消除藥液顏色在本環(huán)節(jié)中造成的誤差。

1.9肝糖原含量檢測(cè) 收集細(xì)胞，1 000 r/min，離心5 min，留細(xì)胞沉淀；用PBS清洗3次，1 000 r/min，離心5 min，棄上清液，留細(xì)胞沉淀。加入0.2 ml的PBS充分混勻，低溫條件下超聲(功率：200 W，超聲3 s，間隔2 s，重復(fù)4次)，制備勻漿液測(cè)定蛋白濃度。加入堿液，置于沸水中煮15 min，室溫冷卻，按照試劑盒隨帶的說明書配制顯色液(室溫、避光)，加入顯色液，置于沸水中煮5 min。于波長(zhǎng)620 nm測(cè)定各管吸光度，計(jì)算出糖原含量。

1.10Western印跡檢測(cè)IRS-1，p-IRS-1,PI3K，p-PI3K，Akt，p-Akt蛋白水平 吸棄各處理組上清，預(yù)冷PBS沖洗2次，每孔加入預(yù)冷放射免疫沉淀(RIPA)細(xì)胞裂解液，冰上裂解，刮取細(xì)胞，4℃下10 000 r/min離心10 min。BCA法測(cè)定細(xì)胞蛋白濃度。制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離膠(10%)和濃縮膠(5%)。上樣總蛋白40 μg，加入電泳緩沖液，電泳電壓及時(shí)間(濃縮膠為80 V，30 min；分離膠為100 V，1 h)。再將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(110 V，90 min)。5%BSA封閉1 h，加入相應(yīng)一抗(1∶1 000)，4℃搖床孵育過夜。Tris-鹽酸緩沖鹽溶液(TBST)洗膜3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗小鼠第二抗體(1∶5 000)，室溫孵育1 h。洗膜5次后，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，拍照。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用ANOVA(多組檢驗(yàn))和StudentT檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用Kruskal-WillisH檢驗(yàn)及Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞存活率 與空白對(duì)照組比較，模型組、苦酸通調(diào)方(100,200 μg/ml)及陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞存活率有所下降，但不明顯(P>0.05)。見表1。

2.2各組HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量 與空白對(duì)照組相比，模型組葡萄糖消耗量下降明顯(P<0.05)；與模型組相比，苦酸通調(diào)方增加細(xì)胞葡萄糖消耗量的效果呈劑量依賴性，且中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組顯著增加HepG2 IR細(xì)胞葡萄糖消耗量(P<0.05)。見表1。

2.3各組HepG2細(xì)胞內(nèi)肝糖原含量 與空白對(duì)照組相比，模型組糖原含量下降明顯(P<0.05)；與模型組相比，苦酸通調(diào)方增加細(xì)胞肝糖原含量的效果呈劑量依賴性，高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組顯著增多(P<0.05)。見表1。

表1 各組HepG2細(xì)胞存活率、葡萄糖消耗量、肝糖原含量

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；表2同

2.4各組HepG2細(xì)胞IRS-1，p-IRS-1,PI3K，p-PI3K，Akt，p-Akt蛋白表達(dá) 與空白對(duì)照組比較，模型組IRS-1，PI3K，Akt磷酸化水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組IRS-1，PI3K，Akt磷酸化水平表達(dá)增加，且各指標(biāo)變化呈現(xiàn)劑量依賴性，高劑量組改變最明顯(P<0.05)。見表2，圖1。

表2 各組HepG2細(xì)胞IRS-1，p-IRS-1,PI3K,p-PI3K,Akt,p-Akt蛋白表達(dá)

圖1 各組HepG2細(xì)胞IRS-1，p-IRS-1,PI3K，p-PI3K，Akt，p-Akt蛋白表達(dá)

3 討 論

2型糖尿病屬于中醫(yī)“消渴”“脾癉”的范疇，苦酸通調(diào)法是“苦酸制甜”、“辛開苦降”、“活血通絡(luò)”、“解毒通絡(luò)”學(xué)說的高度概括，苦酸通調(diào)方由丹參、黃連、黃芪、知母、天花粉、制紅曲、肉桂、烏梅、生地、酒大黃組成。諸藥酸苦同用，辛苦并施，寒溫相佐，達(dá)到了苦酸制甜，辛開苦降，通達(dá)絡(luò)脈之功。

肝臟在胰島素作用下，攝取葡萄糖進(jìn)行糖酵解、合成與分解肝糖原、糖異生等過程，維持機(jī)體糖代謝的平衡。因此，改善肝臟IR狀態(tài)是治療T2DM的重要手段之一。而提高胰島素受體活性，使胰島素與受體結(jié)合及信號(hào)傳遞順暢進(jìn)行，加速葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)存和代謝過程是改善IR的重要方法。肝細(xì)胞內(nèi)胰島素信號(hào)主要通過IRS/PI3K/Akt，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，核因子(NF)-κB，c-Jun氨基末端活化蛋白激酶(JNK)、糖原合成激酶(GSK)等通路進(jìn)行傳導(dǎo)，其中IRS-1/PI3K/Akt信號(hào)途徑是肝臟調(diào)節(jié)糖代謝的主要通路，在信號(hào)傳遞中，胰島素首先與胰島素受體上α亞基，促進(jìn)其β亞基酪氨酸部位發(fā)生磷酸化作用，進(jìn)而與IRS-1相結(jié)合，磷酸化后的IRS-1與PI3K p85亞基相互作用，通過第二信使三磷酸脂酰肌醇(PIP3)與三磷酸脂醇依賴性蛋白激酶(PDK)-1及蛋白激酶C結(jié)合，進(jìn)而激活A(yù)kt，使得PDK-1促進(jìn)Akt(Thy 308)磷酸化，加速葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT)4轉(zhuǎn)運(yùn),增強(qiáng)葡萄糖攝取。同時(shí)使GSK3激活，增加肝糖原合成〔11〕。

本研究表明苦酸通調(diào)方可增強(qiáng)IRS-1/PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，為改善IR治療糖尿病的作用機(jī)制之一。