骨髓間充質干細胞移植在小鼠腦梗死中的作用機制及對大腦HMGB1水平的影響

張桂芳 楊孟麗 常玉霞 高石娟 譚偉麗 李天曉 陳雪梅

(1河南省人民醫院，河南 鄭州 450003；2鄭州大學第一附屬醫院)

腦梗死又稱為缺血性腦卒中，是由于各種原因引起的局部腦組織發生缺血性供應障礙，從而導致腦組織缺氧、缺血或發生變性壞死，繼而產生相應的神經缺損癥狀〔1〕。臨床上將腦梗死發病機制分為腦血栓形成、腔隙性腦梗死與腦栓塞3類，均與動脈粥樣硬化、高血壓、飲食不當及過度精神壓力有關，臨床表現為頭昏、一過性肢體麻木、無力等，嚴重者將危及生命〔2〕。目前，臨床上對于腦梗死多以溶栓、腦神經保護治療為主，雖然能延緩病情發展，降低死亡率，但是遠期預后較差，且存活患者中50.0%～70.0%伴有后遺癥〔3,4〕。骨髓間充質干細胞是一種特殊的細胞，具有取材簡單、免疫原性低、可自體取材等優點，成為腦梗死治療的首選干細胞〔5〕。研究結果表明〔6〕，骨髓間充質干細胞移植能促進腦梗死神經功能恢復且安全，能為腦梗死治療提供思路。但骨髓間充質干細胞治療腦梗死的具體機制尚有待闡明〔7〕。高遷移率族蛋白(HMG)B1是一種高度保守的核蛋白，廣泛分布于哺乳動物中，且隨著晚期促炎作用的進一步研究而成為危重醫學研究熱點〔8〕。研究表明〔9〕，HMGB1是腦梗死早期腦部炎癥相對重要的誘發因子，腦梗死后腦部多數HMGB1均從壞死的神經原中釋放。目前，骨髓間充質干細胞對腦梗死組織中HMGB1低水平的影響研究較少，本文擬探討骨髓間充質干細胞移植在小鼠腦梗死中作用機制及對大腦HMGB1水平影響。

1 資料與方法

1.1實驗動物 參與實驗的C57小鼠45只(7～8 w)，雌雄不限，體質量20～26 g，動物合格證號：SCXK-2007-0003，自由攝食、飲水，光照12 h，建模前12 h禁食。5只用于骨髓間充質干細胞的分離、培養及鑒定；其余40只隨機取10只，設為空白對照組，剩余30只采用線栓法完成腦梗死動物模型建立，建模成功后分為模型對照組、溶劑組與干細胞組各10只。

1.2儀器與設備 胎牛血清(美國Gibco公司)、H-DMEM培養基(美國Hyclone公司)、水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司)、CO2培養箱(Thermo Forma公司)、多聚甲醛(北京化工廠)、高速冷凍離心機(德國賽多利斯公司)、手術器械一套(由醫院提供)、倒置顯微鏡(日本Olympus)。

1.3細胞分離、鑒定 (1)細胞的分離、培養：5只C57小鼠，采用5%水合氯醛進行腹腔注射麻醉，待麻醉生效后常規消毒、鋪巾，取雙側髂骨、脛骨與股骨浸泡在75%酒精中5 min，剝去骨頭上附著的肌肉，剪開骨兩端，采用1 ml注射器抽取磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗骨髓并移至培養皿中，對骨髓懸液進行反復吹打，直到看不見明顯的顆粒細胞懸液〔10〕。將獲得的細胞懸液置入Ficoll淋巴細胞分離液中，3 000 r/min離心30 min，去上清，吸出白膜層，PBS清洗3次，3 500 r/min離心5 min，PBS連續清洗3次，去上清，加入含5%小牛血清的DMEM培養基2 ml，吹打細胞團，讓細胞懸浮于培養基中。取細胞懸液10 μl在細胞計數板上計數，取(5～10)×105/ml細胞培養于25 cm2培養瓶中，37℃ 5%CO2培養箱中培養48 h，去除未貼壁的細胞，倒置顯微鏡下觀察細胞形態；待細胞融合80.0%以上后進行傳代培養，取第3代細胞備用〔11〕。(2)細胞鑒定：分別取骨髓間充質干細胞10×106，將其分為4分，分別加入CD34、CD90、CD73及不加抗體的稀釋液，常溫下孵育30 min，3 500 r/min離心5 min，去上清，加入PBS并不斷吹打細胞，倒置顯微鏡下計數，待細胞孵育良好后采用流式細胞儀完成骨髓間充質干細胞鑒定，重復3次，取平均值〔12〕。

1.4動物模型建立及處理 造模小鼠均采用10.0%水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量3 ml/kg，待麻醉生效后常規消毒、鋪巾。正中部位切開頸前皮膚，完成頸總動脈/頸外動脈、頸內動脈(ICA)的分離，給予動脈夾完成頸總動脈近端與頸外動脈夾閉，利用血管夾夾閉ICA與椎動脈。在頸外動脈近端頸總動脈分叉部位做長2～3 mm的小切口，插入8-0尼龍纖維線，將纖維線送到頸內動脈近端后松開，然后將血管夾打開，繼續前行直到遇到阻力位置，建立短暫性腦缺血小鼠模型，扎緊ICA、椎動脈〔13〕。假體手術組建模后與空白對照組進行常規喂養，經尾靜脈注射生理鹽水1 ml，溶劑組注射200 μl 5%鼠血清的RPMI1640培養基，干細胞組注射骨髓間充質干細胞5×106個(約1 ml)，干預后30 d進行評估。

1.5觀察指標 (1)骨髓間充質干細胞形態、鑒定：在倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁生長及第3代細胞形態；觀察流式細胞儀測定下細胞表面標準物水平〔14〕；(2)神經功能缺損：采用改良神經功能缺損量表(mNSS)對各組建模前、干預后1、10、20及30 d神經缺損進行評估。該量表主要從運動、反射及感覺3方面進行評估，總分18分，分值越低治療效果越理想〔15〕；(3)炎癥因子：各組建模前、干預后30 d尾靜脈采血2 ml，血清分離后采用酶聯免疫吸附試驗測定白細胞介素(IL)-6、IL-10及轉化生長因子(TGF)-β水平〔16〕；(4)HMGB1水平：向上述分離的血清標本加入蛋白酶抑制劑(PMSF)，吹打混合均勻后，4℃ 3 500 r/min離心5～6 min，取其上清為組織總蛋白，采用Western印跡測定各組血清中HMGB1表達水平，以β-actin作內參，采用美國LI-COR公司的Odyssey雙色紅外熒光成像系統對條帶進行分析〔17〕。

1.6統計學分析 采用SPSS18.0軟件進行χ2檢驗、t檢驗。

2 結 果

2.1骨髓間充質干細胞倒置顯微鏡下形態與鑒定 原代骨髓間充質干細胞形態不一，形狀多為梭形；傳代培養后第3代細胞增長迅速、排列具備一定的方向性，多呈旋渦狀生長，但細胞界限不清，見圖1。流式細胞儀測定結果表明：分離獲得的骨髓間充質干細胞CD34占1.4%，CD73為98.6%，CD90為99.1%，說明分離獲得的細胞為骨髓間充質干細胞，見圖2。

圖1 骨髓間充質干細胞倒置顯微鏡形態(×200)

圖2 骨髓間充質干細胞流式細胞儀結果

2.2各組神經功能缺損評分比較 各組建模前神經功能缺損評分均無統計學意義(P>0.05)；干細胞組干預后各時間點神經功能缺損評分均顯著低于溶劑組、模型對照組且顯著高于空白對照組(P<0.05)；溶劑組干預后各時間點神經功能缺損評分均顯著低于模型對照組且顯著高于空白對照組(P<0.05)；模型對照組干預后各時間點均顯著高于空白對照組(P<0.05)；見表1。

表1 各組神經功能缺損評分比較(分，

與空白對照組比較:1)P<0.05；與模型對照組比較:2)P<0.05；與溶劑組比較:3)P<0.05；下表同

2.3各組炎癥因子比較 各組建模前IL-6、IL-10及TGF-β水平比較均無統計學意義(P>0.05)；干細胞組干預后30 d IL-6水平顯著高于溶劑組與模型對照組且顯著低于空白對照組(P<0.05)，IL-10、TGF-β水平均顯著低于溶劑組與模型對照組且顯著高于空白對照組(P<0.05)；溶劑組干預后30 d IL-6水平顯著高于模型對照組且顯著低于空白對照組(P<0.05)，IL-10、TGF-β水平均顯著低于模型對照組且顯著高于空白對照組(P<0.05)；模型對照組干預后30 d IL-6顯著低于空白對照組(P<0.05)，IL-10、TGF-β水平顯著高于空白對照組(P<0.05)。見表2。

2.4各組HMGB1水平比較 干細胞組〔(1.48±0.12)ng/ml〕與空白對照組HMGB1水平〔(1.50±0.12)ng/ml〕比較差異無統計學意義(P>0.05)；干細胞組HMGB1水平顯著高于溶劑組〔(1.03±0.23)ng/ml〕與模型對照組〔(0.74±0.15)ng/ml〕(P<0.05)；溶劑組HMGB1水平顯著高于模型對照組(P<0.05)，見圖3。

表2 各組炎癥因子比較

圖3 各組HMGB1比較

3 討 論

骨髓間充質干細胞是一類源于骨髓的特殊細胞，是干細胞的重要組成部分，能在特定條件下向中胚層組織細胞分化，亦可跨胚層向外胚層、內胚層細胞分化。同時，骨髓間充質干細胞進入人體能主動到達受損部位，用于腦梗死中可發揮神經保護作用，能分泌神經生長因子(NGF)、腦源性神經營養因子(BDNF)等神經保護因子，從而促進腦梗死神經功能恢復〔18〕。本研究說明骨髓間充質干細胞移植能減輕腦梗死小鼠神經損傷，利于恢復。骨髓間充質干細胞移植是一種新型的干預方法，用于腦梗死中能讓植入的細胞代替受損的神經元、內皮細胞，且干細胞的自我更新、分化則能釋放大量的營養因子，能維持、提高機體葡萄糖轉運體作用，從而為大腦提供充足的能力與營養供給，有助于促進受損腦組織修復〔19,20〕。研究表明〔21〕，骨髓間充質干細胞抑制能降解細胞外基質，能促進神經突生長星形膠質細胞在中樞神經受損后發揮抗損傷作用，能支持并保護神經元，為新生組織的修復、再生提供氛圍。

研究表明〔22〕，過度分化的膠原細胞能釋放大量的炎癥因子，導致神經元進一步損傷。IL-6主要由成纖維細胞、T淋巴細胞、B細胞產生，能刺激參與免疫反應，促進細胞增殖、分化。IL-10屬于是一種多細胞源、多功能細胞因子，能調節細胞的生長、分化，參與炎性反應及免疫反應，是公認的炎癥與免疫抑制因子〔23〕。研究表明〔24〕，IL-10在腫瘤、感染、造血系統中發揮了重要的作用。TGF-β是一組新發現的調節細胞生長、分化的TGF-β超家族一員，在特定的條件下促進纖維細胞壁的生長，在組織的修復、炎癥及胚胎發育中發揮了重要作用。研究表明，TGF-β能調節細胞生長、分化，直接參與機體免疫調節〔25〕。研究表明〔26〕，腦梗死常伴有炎癥因子的共同參與，且不同因子能相互作用、相互影響，加劇疾病的發生、發展。而將骨髓間充質干細胞用于腦梗死中則能促進神經功能恢復，改善炎癥因子水平，從根本上控制疾病發展。本研究提示骨髓間充質干細胞能改善腦梗死小鼠炎癥因子水平。

研究表明〔27〕，骨髓間充質干細胞能通過多種方式減輕急性腦梗死小鼠梗死體積，移植后能降低炎癥應激反應。HMGB首次于1973年在牛胸腺中提取、鑒定，而HMGB1是最為豐富的HMG蛋白，能參與細胞骨架的轉錄、調節，能與DNA相互結合，能參與DNA的重組、修復及基因的轉錄調控，在細胞的復制及分化中發揮了重要的作用〔28〕。同時，HMGB1能誘導炎性反應，參與腫瘤細胞的分化、遷移。在腦梗死C57小鼠中，HMGB1多呈低表達，多與腦部組織炎性反應有關〔29〕。本研究說明骨髓間充質干細胞能抑制HMGB1凋亡，延緩病情發展。

綜上，將骨髓間充質干細胞移植用于腦梗死小鼠中有助于減少神經缺損，降低炎癥因子水平，能促進腦組織中HMGB1釋放，能為腦梗死治療提供思路與方法。