類表皮生長因子域7在創(chuàng)傷性腦損傷后腦組織中的表達變化及意義

徐鵬翔 許瓊冠 李強 羅孟亞男 成凱 謝鎮(zhèn)明 付宙鋒

(海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院 1神經外科，海南 570311；2放射治療科)

創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)已成為全球死亡率和發(fā)病率的主要原因〔1〕。腦外傷幸存者經常遭受認知、生理和心理社會功能的暫時或永久性損害。血管生成不僅存在于身體的生長發(fā)育過程中，而且是傷口愈合、缺血、缺氧和炎癥過程中的一種生理現(xiàn)象，與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展和預后密切相關〔2〕。表皮生長因子樣結構域(EGFL)7是近年來發(fā)現(xiàn)的內源性血管生成調節(jié)因子，在胚胎血管生成及大多數(shù)正常成年組織在生理或病理性血管生成過程中起關鍵作用〔3,4〕。EGFL7編碼蛋白含有分泌信號肽序列，該序列具有半胱氨酸(EMI)結構的N-末端以調節(jié)細胞間黏附，兩個與蛋白質鑒定相關的EGF-樣結構及富含賴氨酸和纈氨酸的高保守C-末端〔5〕。體外研究顯示，神經干細胞(NSC)可通過EGFL7參與調控血管的形成，然而EGFL7在TBI中的表達和功能尚不清楚〔6〕。本研究擬通過建立TBI大鼠模型檢測腦組織中EGFL7的表達情況及EGFL7在腦血管生成中的作用機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物 成年雄性SD大鼠，6周齡，體重291～342 g，23℃的室溫下以12 h的暗-光循環(huán)，自由獲取食物和水。隨機分為假手術組(sham，n=10)和TBI組(n=60)，TBI組分為TBI后1 h、6 h、24 h、3 d、7 d、14 d 6個亞組各10只。TBI組進行實驗性腦外傷造模，并在受傷后的上述6個時間點處死。

1.2大鼠TBI模型建立 參照文獻方法建立了彌漫性頭部損傷的大鼠模型〔7〕。每只大鼠腹腔注射4%水合氯醛(50 mg/kg體重)麻醉，同時使用加熱墊維持正常體溫。隨后將頭部固定在立體定位框架中，沿中線制作10 mm切口以暴露顱骨。在保持硬腦膜完整的同時，在冠狀縫線后3.0 mm和矢狀縫側面2.0 mm處進行右開顱(直徑4 mm)。應用1.8～2.0 atm的沖擊壓力制造TBI模型。然后縫線封閉切口，讓大鼠從麻醉中恢復。假手術組僅進行開顱手術。所有手術均在無菌環(huán)境中操作。

1.3收集腦組織標本 分別在TBI后不同時間后處死并采集大腦組織標本。在4%水合氯醛(50 mg/kg體重，腹腔注射)深麻醉下對每組6只進行開胸手術。用0.9%的生理鹽水500 ml加肝素鈉12 500 U通過左心室內灌注，打開右心房，直到流出液清澈為止，采集挫傷區(qū)周圍皮層樣本，立即置于液氮中，進行Western印跡和實時熒光PCR分析。采用0.9%生理鹽水灌注腦組織進行免疫組化分析，浸泡于4℃的4%多聚甲醛緩沖液24 h。

1.4Western印跡分析 將儲存在液氮中的大腦挫傷區(qū)周圍組織樣本解凍，溶解在放射免疫沉淀法(RIPA)緩沖液〔1%乙基苯基聚乙二醇(NP40)，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)，1 mmol/L釩酸鈉(Na3VO4)，1 mmol/L乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)，0.5 mmol/L二硫蘇糖酸(DTT)，20 mmol/L氟化鈉(NaF)，1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)〕中，并補充蛋白酶抑制劑。勻漿在10 000 r/min下4℃離心15 min，然后收集上清液，并測定其中蛋白質濃度。在12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上加載等量(每道 40 μg)蛋白質，在70 V的恒定電壓下電泳30 min，然后在120 V下電泳90 min，最后在300 mA下轉移到聚偏氟乙烯膜。用5%脫脂乳在20℃封閉膜2 h，然后加入兔抗EGFL7抗體(5%脫脂乳中稀釋1∶1 000；美國BioWorld技術公司)、兔抗CD34抗體(5%脫脂乳中稀釋1∶500；美國BioWorld技術公司)和β-actin(5%脫脂乳中稀釋1∶4 000；美國BioWorld公司)孵育過夜。在三乙醇胺緩沖鹽水溶液(TBS)中清洗3次，并在室溫下用適當?shù)睦备^氧化物酶(HRP)結合二級抗體(在吐溫20中稀釋1∶5 000；美國Santa Cruz公司)覆蓋2 h。膜再次清洗3次，并在增強化學發(fā)光檢測系統(tǒng)(英國Amersham Biosciences公司)中孵育，之后暴露于射線照相膠片(日本Fujihyperfilm公司)。根據(jù)平均像素密度計算為靶蛋白/β-actin表達的比率。

1.5RNA分離與實時熒光定量PCR分析 使用Trizol試劑(中國Takara生物技術公司)從冷凍的皮層組織中提取總RNA。用分光光度法(OD260/280范圍1.8～2.0)和1%瓊脂糖凝膠電泳測定RNA的濃度和純度。利用PrimescriptTMRT試劑盒(中國Takara生物技術公司)和寡核苷酸引物將分離出的RNA反轉錄成cDNA。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，所用序列來自大鼠EGFL7和GAPDH的NCBI數(shù)據(jù)庫。大鼠EGFL7正向和反向引物分別為5′-CCGGCCATTTGATGCCT-3′、5′-GCGAGTGCTTTGAGTAGAG-3′；大鼠GAPDH正向和反向引物分別為5′-AATGTCCGTCGTGGATCTGA-3′、5′-AGTGTAGCCCAAGATGCCTT C-3′。采用實時SYBR Green qPCR Master Mix(中國Takara生物技術公司)進行定量實時PCR分析。反應混合物中含有10 μl SYBR預混物Ex Taq、0.8 μl引物(10 μmol/L)、2 μl cDNA和7.2 μl的核酸酶游離水，最終體積為20 μl。在95℃循環(huán)30 s后進行40個PCR循環(huán)，每個循環(huán)包括變性步驟(95℃，5 s)和退火步驟(60℃，30 s)。用GAPDH mRNA的數(shù)量對每個樣品的總RNA濃度進行歸一化，EGFL7基因的表達水平由EGFL7 mRNA與GAPDH mRNA的比率來評估。

1.6免疫組化分析 采用4%多聚甲醛在4℃固定腦組織，石蠟包埋。切割4 μm厚的腦冠狀部(包括挫傷區(qū)和海馬區(qū))進行免疫組化。將切片在磷酸鹽緩沖液(PBS)中用3%的H2O2脫蠟培養(yǎng)10 min，然后用5%的正常胎牛血清在PBS中阻斷2 h。切片在4℃下用兔抗EGFL7抗體(稀釋1∶200；美國BioWorld技術公司)和兔抗CD34抗體(稀釋1∶500；美國BioWorld技術公司)孵育過夜，然后在PBS中洗滌30 min，用HRP標記的山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(稀釋1∶500；美國Santa Cruz公司)室溫下孵育1 h。再次沖洗30 min后，用二氨基聯(lián)苯胺進行免疫標記，蘇木精復染。每個腦組織樣本中隨機選取5個區(qū)域用于細胞計數(shù)。在光學顯微鏡下測定EGFL7、CD34陽性細胞的數(shù)量，并由一名不了解該分組的研究者進行分析。采用6個隨機非重疊區(qū)的EGFL7、CD34陽性細胞平均數(shù)進行統(tǒng)計分析。

1.7細胞轉染 采用人EFGL7基因序列5′-GCACCTACCGAACCATCTATA-3′合成siRNA引物：5′-GATCCGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAAC GTGACACGTTCGGAGAACTTTTTTG-3′和5′-AATTCAAAAAAGTTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGA AACGTGACACGTTCGGAGAACG-3′。退火后，將引物與線性穿梭質粒病毒載體(pLV3)連接，形成pLV3/siRNA/EGFL7復合物，用于轉染課題組前期建立的NSC和內皮細胞(HUVEC)共培養(yǎng)系統(tǒng)〔6〕，具體方法為采用0.4 μm孔徑的Transwell小室將NSCs和HUVECs以1∶1比例〔(1×104)∶(1×104)〕分隔培養(yǎng)，Transwell小孔放置NSCs，24孔平板中接種HUVECs。共培養(yǎng)24 h后將含8 μg/ml聚布倫的DMEM全培養(yǎng)基稀釋EGFL7-siRNA轉染載體加到含有NSC-HUVEC共培養(yǎng)系統(tǒng)中融合，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，收集細胞并按照1.4中方法分析EGFL7、CD34、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化(p)-AKT蛋白表達。對照組僅加入DMEM全培養(yǎng)基。

1.8統(tǒng)計學分析 采用SPSS18.0軟件進行單因素方差分析、Post Hoc檢驗。

2 結 果

2.1TBI誘導EGFL7和CD34表達上調 EGFL7 mRNA、蛋白及CD34蛋白水平在腦外傷后24 h顯著升高(P<0.05,P<0.01)，第3天達峰值，并持續(xù)至少14 d。見表1。

表1 腦外傷后不同時間點挫傷周圍皮層EGFL7 mRNA的表達水平和EGFL7和CD34的蛋白表達

與sham組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

2.2挫傷周圍皮層和同側海馬區(qū)EGFL7和CD34陽性細胞數(shù) 與假手術組相比，TBI大鼠挫傷周圍皮層和海馬區(qū)EGFL7和CD34陽性細胞顯著增加(P<0.01)，見圖1、2，表2。

圖1 TBI大鼠挫傷周圍皮層和海馬區(qū)EGFL7陽性細胞(免疫組化，×100)

圖2 TBI大鼠挫傷周圍皮層和海馬區(qū)CD34陽性細胞(免疫組化，×100)

組別周圍皮層EGFL7CD34同側海馬區(qū)EGFL7CD34sham組26±448±618±336±5TBI 3 d亞組88±91)155±101)73±71)88±81)

與sham組比較：1)P<0.01

2.3沉默EGFL7對NSC-HUVEC共培養(yǎng)系統(tǒng)的p-AKT、AKT、PI3K表達影響 特異性siRNA干擾致EGFL7的蛋白表達明顯受到抑制后，EGFL7-siRNA表達載體轉染組NSC-HUVEC共培養(yǎng)系統(tǒng)的CD34、AKT、p-AKT、PI3K蛋白的相對表達均較對照組顯著降低(P<0.05,P<0.01)，見表3、圖3。

表3 NSC-HUVEC共培養(yǎng)系統(tǒng)經EGFL7-siRNA轉染72 h后EGFL-7、CD34、p-AKT、AKT、PI3K蛋白表達

與對照組比較:1)P<0.05，2)P<0.01

圖3 NSC-HUVEC共培養(yǎng)系統(tǒng)經EGFL7-siRNA轉染72 h后EGFL-7、CD34、p-AKT、AKT、PI3K蛋白的表達

3 討 論

血管生成能為組織提供氧氣和營養(yǎng)，改善組織缺血，促進受損腦組織的結構重塑，從而加速神經功能的修復〔8〕。因此，促進血管生成可能是治療腦外傷后缺血性腦損傷的一種新方法。血管生成是一個復雜的過程，對神經細胞的修復和大腦損傷后的功能恢復至關重要〔9〕。EGFL7是一種新的促血管生成因子，在胚胎發(fā)育過程中對血管生成起關鍵調節(jié)作用。在正常成人組織中，EGFL7表達下調或不表達，但在富含血管的組織(包括肺、心臟和子宮)中處于高水平表達〔10〕。EGFL7在生理或病理條件下重新激活，參與血管生成〔6〕。此外，EGFL7的高表達與幾種腫瘤類型中的血管形成有關，包括結腸、胃、乳腺、腎、肝和腦腫瘤〔11～13〕。本研究表明EGFL7表達可能是促進腦損傷后血管生成的關鍵因素。盡管以前的研究表明EGFL7是由血管HUVEC或其前體細胞分泌〔12〕，但本研究免疫組織化學染色顯示，在TBI大鼠挫傷周圍皮層和海馬區(qū)中，EGFL7均有表達。EGFL7在神經細胞中的表達也被證實。這可能意味著在神經細胞中存在先前未識別的EGFL7功能，即在HUVEC上或兩者上存在旁分泌血管生成功能。總的來說，這些發(fā)現(xiàn)似乎是EGFL7應對腦損傷后血管生成的關鍵因素，了解TBI大鼠挫傷進展過程中EGFL7的表達是如何啟動的及控制EGFL7的位置和表達的因素將有助于理解腦外傷修復的細胞和分子機制。研究證實，在EGFL7高表達情況下，HUVEC可形成較多的管道樣結構，而將EGFL7基因沉默后，上述管道樣結構消失，說明NSCs可通過EGFL7參與調控血管的形成〔6，14〕。基于這些發(fā)現(xiàn)，本研究顯示EGFL-7基因沉默顯著抑制了NSC-HUVEC共培養(yǎng)系統(tǒng)中p-AKT、PI3K蛋白表達及HUVEC的血管生成能力。PI3K/AKT信號通路是執(zhí)行多種生物學功能的信號調控系統(tǒng)，如細胞存活、增殖，代謝調控和細胞遷移等〔15,16〕。PI3K活化后在細胞膜上生成PIP3，并與信號蛋白分子AKT結合并活化AKT〔17〕。Karar等〔18〕研究顯示AKT的持續(xù)內皮激活誘導血管的發(fā)育和血管管腔結構的形成。因此，上述結果提示EGFL-7可能通過PI3K/AKT通路參與NSCs的血管生成。