運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)對(duì)急性心肌缺血大鼠心肌細(xì)胞凋亡及凋亡蛋白表達(dá)的影響

胡陽(yáng) 鄧潔 王婷婷 蘇慧鵬 楊永麗 王煜

(昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，云南 昆明 650051)

缺血性心臟病通常是由于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈血流減少引起心肌缺血為特征的一種疾病，可以伴有心絞痛、心肌梗死、心肌重構(gòu)、心力衰竭、心律失常，最終死亡，又統(tǒng)稱為冠心病。運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)(EP)是指一定強(qiáng)度的間斷可重復(fù)的激烈運(yùn)動(dòng)造成反復(fù)的短暫缺血，這種運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)，提高機(jī)體耐受缺血缺氧的能力。因?yàn)榧ち疫\(yùn)動(dòng)可作為一種應(yīng)激，極大提高心肌耗氧量，造成暫時(shí)的心肌缺血〔1,2〕。本研究主要通過(guò)觀察EP對(duì)動(dòng)脈硬化急性心肌缺血大鼠心肌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)表達(dá)的影響，探討EP可能影響凋亡基因的表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡而起到內(nèi)源性心肌細(xì)胞保護(hù)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及儀器、試劑 由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的SD大鼠90只，7周齡,體重(230±20)g。電子天平(Sartorius公司，德國(guó))、電熱恒溫水浴槽(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠)、-80℃低溫冰箱(SANYO，日本)、4℃低溫冰箱(青島海爾冰箱股份有限公司)、微量加樣吸頭(北京鼎國(guó)生物有限公司)、制冰機(jī)(AF10 SCOTSMAN,美國(guó))、微量加樣器(Gilson公司，法國(guó))、聚偏氟乙烯(PVDF)膜(孔徑為0.22 μm， Millipore，美國(guó))、去離子水儀(PALL,Purelab Plus，美國(guó))、3 mm濾紙(Whatman，英國(guó))、通用顯影粉、酸性定影粉(天津亨達(dá)公司感光材料廠)、高速離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠)、旋渦混勻器(海門麒麟醫(yī)用儀器廠)、電泳儀(北京百晶生物技術(shù)有限公司)、低溫離心機(jī)(Sigma，德國(guó))、凝膠玻璃板、固定夾(BIO-Rad，美國(guó))、轉(zhuǎn)移脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造公司)、垂直電泳槽(BIO-Rad，美國(guó))、轉(zhuǎn)移電泳槽(BIO-Rad，美國(guó))、PV二抗試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、蘇木素染色液(河北博海生物工程開(kāi)發(fā)有限公司)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、無(wú)水乙醇、95%乙醇(昆明南疆制藥公司)、分化液、返藍(lán)液(河北博海生物工程開(kāi)發(fā)有限公司)、中性樹(shù)膠(中國(guó)上海懿洋儀器有限公司)、二甲苯(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)、伊紅染色液(河北博海生物工程開(kāi)發(fā)有限公司)、切片機(jī)(RM2016，德國(guó)萊卡)、攤烤片機(jī)(KD-T，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)、生物安全柜(SW.TFG-15，廣州瑞智凈化設(shè)備有限公司)、鹽酸異丙腎上腺素注射液(合肥都邦生物制藥有限公司)、多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)(RW6240CD，成都儀器廠)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇與分組 將SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(A組)10只、急性心肌缺血組(B組)20只、動(dòng)脈硬化+急性心肌缺血組(C組)20只、EP+急性心肌缺血組(D組)20只、動(dòng)脈硬化+EP+急性心肌缺血組(E組)20只。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，每天進(jìn)行15 min無(wú)負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)。

1.3動(dòng)脈硬化模型 動(dòng)脈硬化模型采用維生素D3連續(xù)灌胃4 d，喂高脂飼料(93.7%基礎(chǔ)飼料、5%豬油、0.2%膽酸、0.1%甲基硫氧嘧啶)6 w。主動(dòng)脈經(jīng)10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水包埋、切片、蘇木素-伊紅(HE)染色觀察。

1.4EP EP動(dòng)物模型的建立參照Margonato等〔3〕的方法，EP組大鼠以尾部負(fù)重體重的3%物體進(jìn)行間歇性游泳運(yùn)動(dòng)，以模擬反復(fù)多次短暫的心肌相對(duì)缺血。整個(gè)過(guò)程持續(xù)3 d，每天運(yùn)動(dòng)1 h，游泳15 min，休息5 min，重復(fù)3次。

1.5急性心肌缺血 B組腹腔注射3 mg/kg異丙腎上腺素(ISO)，復(fù)制急性心肌缺血損傷模型，其余組同時(shí)腹腔注射等量生理鹽水。針形電極置于大鼠四肢皮下，連續(xù)記錄心電圖(ECG)。ECG變化為：T波由正變負(fù)或雙相，并伴有J點(diǎn)抬高，心室除極波(QRS)增寬，心律失常。建模成功后24 h內(nèi)采用脊髓脫臼法處死大鼠后，根據(jù)各種檢測(cè)指標(biāo)的方法留取左心室組織保存以備檢測(cè)。

1.6心肌組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的免疫組化 取左心室心肌組織，采用鏈酶親和素-生物素-酶復(fù)合物(SABC) 免疫組化檢測(cè) Bcl-2，Bax 蛋白，脫蠟、水化。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，各5 min。用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉5～10 min，蒸餾水洗3次；抗原修復(fù)；PBS洗5 min。滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min。甩去多余液體。滴加Ⅰ抗，室溫1 h或者4℃過(guò)夜或者37℃1 h(4℃過(guò)夜后在37℃復(fù)溫45 min)。PBS洗3次，每次2 min。滴加生物素化二抗，20～37℃ 20 min。PBS洗3次，每次2 min。滴加試劑鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(SABC)，20～37℃ 20 min。PBS洗4次，每次5 min。DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色(鏡下掌握顯色程度)。蒸餾水洗。蘇木素復(fù)染2 min、鹽酸酒精分化。脫水、透明、封片、鏡檢。顯微鏡觀察：選擇各組的陽(yáng)性和陰性組織進(jìn)行照相。陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn):以細(xì)胞質(zhì)著棕黃色為陽(yáng)性，用計(jì)算機(jī)圖像處理系統(tǒng)，每次隨機(jī)選 10 個(gè)視野，計(jì)算蛋白陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)(PEI)，PEI=平均光密度×陽(yáng)性細(xì)胞百分比×100。

1.7Western印跡檢測(cè) 將100 mg的心肌組織塊置于1～2 ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。 加400 μl單去污劑裂解液裂(含苯甲基磺酰氟)于勻漿器中勻漿后置于冰上。幾分鐘后再碾一會(huì)兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。裂解30 min后，即可用移液器將裂解液移至1.5 ml離心管中，然后在4℃下12 000 r/min離心5 min，取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于-20℃保存。進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，轉(zhuǎn)膜。將膜用Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBS)從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床搖動(dòng)封閉1 h。 將一抗用TBS緩沖液加吐溫-20(TBST)稀釋至適當(dāng)濃度(在1.5 ml離心管中)；將抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，室溫下孵育1～2 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗2次，每次10 min；再用TBS洗1次，10 min。加入半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3(1∶1 000) 一抗 4℃孵育過(guò)夜，再次洗膜后同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育1～2 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗2次，每次10 min；再用TBS洗1次，10 min，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。顯影、定影，將膜蛋白面朝下，去盡殘液，包好，放入X-光片夾中。將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)、單因素方差分析、Mann-WhitneyU檢驗(yàn)、Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.15組存活情況 A組存活率為100%，B組為65%(13/20)，C組為75%(15/20)，D組為90%(18/20)，E組為70%(14/20)。

2.2各組Bcl-2及Bax表達(dá)情況 與A組比較，B、C、E組Bcl-2、Bcl-2/Bax均顯著降低(P<0.05)，B、C、D、E組Bax均顯著升高(均P<0.05)。與B組比較，D組、E組Bcl-2、Bcl-2/Bax均顯著升高(P<0.05)，C組Bax顯著升高，D組、E組Bax顯著降低(均P<0.05)。與C組比較，D組、E組Bcl-2、Bcl-2/Bax均顯著升高，Bax顯著降低(均P<0.05)。與D組比較，E組Bcl-2、Bcl-2/Bax均顯著降低，Bax顯著升高(均P<0.05)。見(jiàn)表1，圖1。

表1 實(shí)驗(yàn)后各組Bcl-2及Bax表達(dá)比較

與A組比較：1)P<0.05;與B組比較：2)P<0.05;與C組比較：3)P<0.05;與D組比較：4)P<0.05

圖1 各組Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)(SP，×400)

2.3各組心臟 Caspase-3 蛋白表達(dá) 與A組(0.186±0.072)相比，B組(0.673±0.125)、C組(0.737±0.096)、D組(0.425±0.069)、E組心臟 Caspase-3 蛋白表達(dá)水平(0.498±0.083)顯著升高(P<0.01);與B組、C組相比，D組、E組心臟 Caspase-3 蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)。 與D組比較，E組心臟 Caspase-3 蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P>0.05);見(jiàn)圖2。

圖2 各組心肌組織Caspase-3蛋白表達(dá)

2.4各組細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)比較 A組AI(0.030±0.002)顯著低于B組(0.290±0.002)、C組(0.351±0.003)、D組(0.215±0.004)及E組(0.260±0.003，P<0.05)；B組顯著高于D組、E組，顯著低于C組(P<0.05)；E組顯著低于C組，且顯著高于D組(P<0.05)。

3 討 論

缺血預(yù)適應(yīng)指反復(fù)短暫的心肌缺血，對(duì)心肌產(chǎn)生保護(hù)作用，使心肌對(duì)更長(zhǎng)時(shí)間缺血的耐受性增強(qiáng)，這一現(xiàn)象稱心肌缺血預(yù)適應(yīng)。缺血預(yù)適應(yīng)可達(dá)到縮小心肌缺血面積的作用，就目前來(lái)說(shuō)任何藥物無(wú)法達(dá)到這樣的保護(hù)作用。并且，缺血預(yù)適應(yīng)能顯著地改善再灌注后心肌收縮和舒張功能，減少心律失常時(shí)間發(fā)生。激烈運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌有損傷，加重心肌缺血缺氧，但間斷反復(fù)的激烈運(yùn)動(dòng)可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)，達(dá)到提高機(jī)體耐受缺血缺氧的能力，這種能力被稱為EP，生理性模仿缺血預(yù)適應(yīng)。

研究發(fā)現(xiàn)在缺血、缺氧及缺血-再灌注過(guò)程中心肌細(xì)胞不僅出現(xiàn)壞死還發(fā)生凋亡〔4〕。起初凋亡細(xì)胞數(shù)量多于壞死細(xì)胞，心肌細(xì)胞凋亡主要位于梗死邊緣區(qū)，若能抑制心肌細(xì)胞凋亡。目前研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡存在兩種主要的相關(guān)心肌細(xì)胞受損途徑〔5〕：線粒體途徑(內(nèi)源性途徑)和細(xì)胞表面死亡受體途徑(外源性途徑)。在內(nèi)源性途徑中Bcl-2家族起重要作用。Bcl-2家族中Bcl-2和Bax與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，Bcl-2為抗凋亡基因，Bax為促凋亡基因，兩者平衡影響凋亡的發(fā)生。本研究說(shuō)明，急性心肌缺血可導(dǎo)致心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。急性心肌缺血可促使心肌細(xì)胞凋亡，使心肌細(xì)胞功能受損〔6〕。

本研究說(shuō)明，EP可能減少心肌細(xì)胞凋亡，上調(diào)控與細(xì)胞保護(hù)有關(guān)的內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)的基因Bcl-2表達(dá)、減少Bax促凋亡基因的表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡來(lái)保護(hù)心臟與相關(guān)研究結(jié)果一致〔7，8〕。彭峰林等〔9〕研究 EP 對(duì)缺血/再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明無(wú)論是高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)，還是一次高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)都能減少缺血/再灌注心肌細(xì)胞的凋亡，使Bcl-2表達(dá)上調(diào) 和 Bax表達(dá)下調(diào)， Bcl-2/Bax 比值增加，EP 心肌保護(hù)的重要機(jī)制之一可能是通過(guò)減少心肌細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因調(diào)節(jié)而獲得的。

Caspase 家族是一組半胱氨酸蛋白酶，在執(zhí)行細(xì)胞凋亡的作用中發(fā)揮重要作用，其中成員 Caspase-3 則是通過(guò)對(duì)蛋白激酶、核酸酶及細(xì)胞骨架的裂解，直接使細(xì)胞發(fā)生凋亡，因此Caspase-3被認(rèn)為是執(zhí)行死亡蛋白酶〔10，11〕。提示 EP 可能通過(guò)抑制Caspase-3 蛋白表達(dá)而減少心肌細(xì)胞凋亡，起到保護(hù)心肌的作用。相關(guān)研究顯示，EP對(duì)海馬CA1神經(jīng)元缺血再灌注損傷通過(guò)調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2比值和抑制Caspase-3活化起到同樣保護(hù)作用〔12〕。另有研究證實(shí) EP 能減少缺血引起心肌梗死的面積，增強(qiáng)心肌抗凋亡作用，有助于缺血后心功能恢復(fù)〔11〕。EP還具有抵抗異丙腎上腺素導(dǎo)致的急性心肌損傷的作用〔13〕。

Sun等〔14〕研究顯示，EP顯著減輕力竭運(yùn)動(dòng)所致心肌缺血損傷，血清心肌肌鈣蛋白(cTn)I水平降低，心肌梗死面積減少，心肌凋亡減少，Bcl-2水平升高，Caspase-3水平降低，非受體酪氨酸激酸(JAK)2和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3磷酸化升高。EP通過(guò)激活JAK2/STAT3信號(hào)通路發(fā)揮心臟保護(hù)作用，減少心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌缺血損傷〔14〕。Bcl-2、Bax在Caspase-3的上游調(diào)控機(jī)制中起到重要作用，參與對(duì)Caspase-3活性的調(diào)節(jié)；Bcl-2、Bax還可作為Caspase-3的直接底物起作用，因此Bcl-2、Bax與Caspase-3在細(xì)胞凋亡傳導(dǎo)過(guò)程中相互聯(lián)系又相互制約〔15〕。本研究證實(shí)EP可能通過(guò)促進(jìn)心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax的表達(dá)，降低Caspase-3水平抑制心肌細(xì)胞凋亡來(lái)保護(hù)心臟，證實(shí)反復(fù)間斷一定強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌缺血的保護(hù)作用，急性運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的心臟預(yù)處理能夠激活多種途徑，對(duì)缺血事件提供即時(shí)保護(hù)，降低可能致命的缺血心肌損傷的嚴(yán)重程度，并作為生理的第一道防線。不依賴于長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)危險(xiǎn)因素的保護(hù)作用和心血管系統(tǒng)的適應(yīng)，心血管預(yù)處理可能有助于運(yùn)動(dòng)的即時(shí)心臟保護(hù)。在實(shí)踐中，這意味著1次運(yùn)動(dòng)可以產(chǎn)生臨床相關(guān)的心臟保護(hù)〔16〕。運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的預(yù)處理依賴于幾個(gè)共同作用的因素來(lái)保護(hù)心臟。包括一氧化氮(NO)信號(hào)通路改變、熱休克蛋白(HSPs)水平升高、三磷酸腺苷(ATP)敏感鉀通道功能增強(qiáng)、阿片類藥物系統(tǒng)活化增強(qiáng)、抗氧化能力增強(qiáng)可能有助于運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的心臟保護(hù)〔17〕。從運(yùn)動(dòng)直接誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生適應(yīng)性細(xì)胞保護(hù)的角度為缺血性心臟病的預(yù)防治療提供新的思路。