八月札水提物對(duì)H22荷瘤小鼠突變型P53、Bcl-2和增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)的影響

白雪 崔文超 王麗敏 王偉群 張金波 王嘉淇 劉麗蘭 盧燁 邵欣雨 侯慶澤

關(guān)寶生2，3

(1佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2黑龍江省痛風(fēng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3佳木斯大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院)

八月札又名預(yù)知子〔1〕，也叫八月瓜，是木通科植物木通、三葉木通、白木通的果實(shí)。八月札是一種無毒副作用的野生佳果，又是一種名貴的藥材，其種子、莖、葉、根亦可入藥。在《抗癌中藥大辭典》中記載其對(duì)消化系統(tǒng)腫瘤和乳腺癌有較好的治療作用。本研究揭示八月札水提物對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康昆明種小鼠90只，雌雄各半(5周齡，體重18～22 g)，由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)：SYXK黑20030014)，室溫環(huán)境中顆粒飼料分籠飼養(yǎng)、自由飲水、定期紫外線消毒。

1.2腫瘤接種 取瘤源鼠〔2〕腹水稀釋后注射于上述小鼠左前腋下，術(shù)后觀察行為有無異常；如無異常，第2天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組。期間所有小鼠常規(guī)飲食。

1.3分組及給藥劑量 試驗(yàn)共分成6組(每組15只)，對(duì)照組、環(huán)磷酰胺陽性對(duì)照組(CTX組)、八月札水提物組〔水提低組(19.5 g/kg·d)、水提高組(39 g/kg·d)〕、聯(lián)合用藥組(水提低+CTX組和水提高+CTX組)。

1.4八月札水提物的制備及給藥方法 見課題組前期發(fā)表文章〔2〕。腫瘤抑制率(%)=(1-給藥組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)×100。

1.5肝腎和腫瘤組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 取各組肝臟和腎臟組織，用4℃磷酸鹽緩沖液(PBS)洗凈，取部分組織固定于10%甲醛溶液中后進(jìn)行石蠟包埋和切片，經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6免疫組化法檢測各組腫瘤組織中突變型(m)P53、Bcl-2和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá) 取腫瘤組織切片，按照免疫組化試劑盒說明書操作，在光學(xué)顯微鏡下觀察mP53、Bcl-2和PCNA蛋白表達(dá)。陽性表達(dá)判定：①mP53和PCNA蛋白的判定標(biāo)準(zhǔn)：可見清晰褐色細(xì)胞核表達(dá)的是陽性細(xì)胞，藍(lán)色細(xì)胞核是陰性細(xì)胞；②Bcl-2陽性表達(dá)的判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞質(zhì)、核膜和胞膜有棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡(40×10倍)視野中陽性細(xì)胞百分率，細(xì)胞著色>10%則判定為陽性標(biāo)本。

1.7統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和組間SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組腫瘤的抑制率 與對(duì)照組比較，其他組腫瘤重量明顯降低；與CTX組比較，水提低+CTX組和水提高+CTX組腫瘤的重量明顯降低，腫瘤抑制率顯著升高(P<0.05)；與水提低組比較，水提低+CTX組和水提高+CTX組腫瘤重量明顯降低，腫瘤抑制率顯著升高(P<0.05)；且八月札單方及聯(lián)合用藥組小鼠存活的數(shù)量明顯高于對(duì)照組和CTX組(P<0.05)。見表 1。

表1 各組腫瘤抑制率

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與CTX組比較：2)P<0.05；與水提低組比較：3)P<0.05；表2同

2.2各組腎臟和肝臟毒性 各組腎臟的大體外觀呈鮮紅色，表面光滑，大小正常，質(zhì)地均勻，未見明顯異常。光學(xué)顯微鏡下，對(duì)照組和水提高組腎小球血管球與球囊界限清楚，近曲小管界限清晰，上皮輕度水腫。CTX組腎小球球囊腔變小，血管球與球囊界限不清，近曲小管上皮水腫，間質(zhì)有少許炎細(xì)胞。水提高+CTX組腎小球體積輕度增大，血管球與球囊界限清楚，近曲小管上皮輕度水腫，管壁輕度增厚，間質(zhì)有少許炎細(xì)胞。

各組肝臟的大體外觀呈暗紅色，大小正常、質(zhì)地均勻、表面光滑，未見明顯異常。光學(xué)顯微鏡下，對(duì)照組和水提高組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞條索排列規(guī)整，圍繞中央靜脈呈放射狀排列。大體和顯微鏡下觀察均未發(fā)現(xiàn)明顯的病理學(xué)變化。CTX組肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞排列緊密且不規(guī)則，存在輕度水腫，胞質(zhì)疏松化，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化。水提高+CTX組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞條索排列規(guī)整，圍繞中央靜脈呈放射狀排列，存在輕度水腫，顯微鏡下觀察可見輕微的病理變化。見圖1。

圖1 各組腎臟、肝臟組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(HE，×200)

2.3各組腫瘤組織細(xì)胞形態(tài)學(xué) 對(duì)照組腫瘤組織細(xì)胞大小不一、外形不規(guī)則，細(xì)胞核較大、呈多形性、染色質(zhì)深染；其余各組腫瘤組織團(tuán)塊中央出現(xiàn)不同程度的壞死；水提高組腫瘤組織團(tuán)塊中央可見壞死灶，腫瘤細(xì)胞的數(shù)目明顯減少，伴有炎細(xì)胞浸潤；水提高+CTX組腫瘤組織團(tuán)塊中央可見大面積壞死，腫瘤細(xì)胞數(shù)量明顯減少，并伴有炎細(xì)胞浸潤。見圖2。

圖2 各組腫瘤組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(HE，×200)

2.4各組腫瘤組織細(xì)胞mP53、Bcl-2和PCNA蛋白表達(dá) 與對(duì)照組比較，CTX組、水提低組、水提高組和水提低+CTX組、水提高+CTX組腫瘤組織中mP53、Bcl-2和PCNA蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0.05)；水提低+CTX組、水提高+CTX組對(duì)3種蛋白的調(diào)控作用最強(qiáng)，其次是CTX組和水提高、水提低組，但各組間未見顯著性差異。見表2，圖3。

表2 各組腫瘤細(xì)胞mP53、Bcl-2和PCNA蛋白表達(dá)

圖3 各組腫瘤組織中PCNA、mP53、Bcl-2蛋白的表達(dá)(DAB，×200)

3 討 論

八月札主要化學(xué)成分為三萜或三萜皂苷，但在國內(nèi)外對(duì)其抗腫瘤作用的研究報(bào)道較少。本研究結(jié)果提示八月札與化療藥物CTX聯(lián)合應(yīng)用，對(duì)化療藥物具有一定的增效、減毒作用〔3〕。細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束其生命的過程〔4～6〕。它是一系列酶參與，并受多種基因調(diào)控的一種細(xì)胞的主動(dòng)死亡過程。分子腫瘤學(xué)研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡規(guī)律的失常與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡的調(diào)控是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，體內(nèi)的多種蛋白參與這一過程，這其中比較熟知的有促進(jìn)凋亡發(fā)生的基因〔比如野生型(wt)P53、bax和Fas/ FasL等基因〕，還有一些抑制凋亡發(fā)生的基因(比如mP53和Bcl-2等基因)及死亡受體及其配體和Caspase家族基因等〔7〕。

近年來，P53和Bcl-2基因是受關(guān)注較多的，與細(xì)胞凋亡發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)的基因。P53基因定位于17p13，現(xiàn)在已知的主要分為wtP53和mP53。wtP53具有阻滯細(xì)胞分裂的功能，在維護(hù)基因組完整性、抑制癌基因轉(zhuǎn)錄活性等方面起關(guān)鍵作用，是一種抑癌基因，半衰期僅20 min〔7〕。當(dāng)P53基因突變后穩(wěn)定性大幅提升，半衰期達(dá)到24 h，并喪失其抑癌基因的功能，但卻可以促進(jìn)內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤組織內(nèi)部血管形成〔7～10〕。P53在不同腫瘤組織中突變效率差異較大，mP53在直腸癌和卵巢癌組織中表達(dá)高達(dá)50%～70%，在宮頸癌組織中表達(dá)亦達(dá)到40%～60%；由此可見，P53突變程度與腫瘤發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，其突變率越高在一定程度上提示腫瘤惡性程度越高、侵襲性也更強(qiáng)，但現(xiàn)有研究顯示其與腫瘤臨床病理分期關(guān)系不明顯〔7，11～14〕。本研究結(jié)果提示八月札可能通過抑制P53突變從而發(fā)揮抑癌基因的作用。另外，P53還具有啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的作用，提示八月札的抗腫瘤作用可能與其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

Bcl-2家族基因定位于18q21.3，分為促凋亡基因和抗凋亡基因兩種。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的Bcl-2家族成員包括促進(jìn)細(xì)胞凋亡的Bcl-xs、Bim、Hrk、Bax和Bak等基因〔7，15，16〕；抗細(xì)胞凋亡的Bcl-2、Mcl-1、Bcl-w、Bcl-x1和Bfl-1等基因〔17〕。當(dāng)體內(nèi)Bcl-2基因家族中促凋亡和抗凋亡基因表達(dá)平衡被破壞時(shí)，其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用被削弱，腫瘤也就發(fā)生了〔7，18～21〕。PCNA是一種特異性的核酸蛋白，存在于正常增殖細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞增殖周期的各個(gè)時(shí)期〔22〕，其表達(dá)水平反映了細(xì)胞增殖的程度，隨著肝癌細(xì)胞損傷程度增加，其表達(dá)率明顯升高。PCNA是DNA聚合酶δ的輔助因子，其含量具有周期性，在細(xì)胞分裂的靜止期內(nèi)含量很少，G1晚期開始增加，S期達(dá)高峰，G2期、M期明顯下降，可見PCNA量的變化與DNA合成一致，可以作為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)〔23，24〕。本研究結(jié)果提示八月札可能通過下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生的時(shí)候，Bcl-2家族的促凋亡蛋白被激活，并易位到線粒體膜上破壞其完整性，釋放促凋亡因子，最后經(jīng)過細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的逐級(jí)放大作用誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生〔7〕。

由此可推測，八月札可能通過下調(diào)抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，阻止mP53蛋白的生成，進(jìn)而誘導(dǎo)H22肝癌細(xì)胞的凋亡，從而阻止腫瘤細(xì)胞的生長和增殖。另外，八月札和CTX能夠抑制腫瘤細(xì)胞中PCNA蛋白的表達(dá)，提示八月札可能具有阻止腫瘤細(xì)胞DNA合成的作用，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。