血管性癡呆患者血清miR-17和VEGF表達(dá)及相關(guān)性

李軍 李星 牛犇

(南陽市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 南陽 473000)

血管性癡呆(VD)是指由于進(jìn)入到大腦的血流量減少，造成機(jī)體記憶、認(rèn)知及行為功能障礙的進(jìn)行性疾病。研究表明，腦卒中及腦缺血缺氧等均可引發(fā)VD，而吸煙、高齡、低血壓患者、有家族病史者較常人更易患VD〔1〕。miR-17是微小RNA(miRNA)中的一種，能夠參與細(xì)胞的增殖、凋亡等一系列生物學(xué)活動及機(jī)體免疫調(diào)節(jié)過程。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種具有高度生物活性的糖蛋白，是血管生成的關(guān)鍵性生物活性因子，可有效誘導(dǎo)血管新生，增加血管通透性〔2〕。近年來研究表明，血管性危險因素可能參與VD的疾病進(jìn)程，miR-17和VEGF表達(dá)異常可能與疾病相關(guān)的調(diào)控過程異常有關(guān)〔3〕。本研究通過檢測VD患者血清中miR-17和VEGF的表達(dá)情況，并探討二者的表達(dá)關(guān)系及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年2月至2019年1月在南陽市中心醫(yī)院就診的87例VD患者作為觀察組，男49例，女38例，年齡60～81歲，平均年齡(73.28±7.43)歲，同期選取來院參與體檢的健康者65例作為對照組，男37例，女28例，年齡61～82歲，平均年齡(74.03±7.85)歲。對所有受試者采用簡易智能狀態(tài)檢測(MMSE)量表進(jìn)行評分測試，測試均由專業(yè)醫(yī)師在醫(yī)院心理測量室完成。其中MMSE評分在28～30分者為正常，20分≤MMSE評分<28分為輕度癡呆，10分≤MMSE評分<20分為中度癡呆，10分

VD納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合VD的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔4〕；②患者M(jìn)MSE評分均低于28分；③頭部CT檢查正常；④患者及其家屬已簽字確認(rèn)均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①心、腦、肝、腎功能異常者；②有自身免疫性疾病、內(nèi)分泌疾病及惡性腫瘤疾病；③發(fā)病前有認(rèn)知功能障礙、精神障礙及失語者；④具有成癮性藥物病史；⑤資料不全者。兩組一般資料相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》，并經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會討論，批準(zhǔn)后進(jìn)行研究。

1.2主要試劑及儀器 RNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara公司，SYBR?Green試劑盒購自北京普凱瑞生物科技有限公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成，多功能酶標(biāo)儀、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)儀購自美國Bio-Rad公司，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司。

1.3研究方法

1.3.1樣本采集與保存 于清晨空腹時采集受試者靜脈血5 ml于真空干燥管中，靜置30 min后，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min在4℃離心機(jī)上離心10 min，取上清立即進(jìn)行試驗(yàn)或分裝后保存于-80℃冰箱待測，樣本應(yīng)避免反復(fù)凍融。

1.3.2受試者血清miR-17水平測定 采用RNA提取試劑盒提取RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA。采用定量PCR儀進(jìn)行miR-17擴(kuò)增。qRT-PCR采用SYBR?Green試劑盒，反應(yīng)體系為10 μl，miScript SYBR?Green Mix 5 μl，cDNA(50 ng/μl)1 μl，上下游引物(10 μmol/L)均為0.5 μl，雙蒸水(ddH2O)3.0 μl。具體步驟詳見說明書，miR-17反應(yīng)條件：95℃：30 s；95℃：10 s；60℃：35 s，共40個循環(huán)。

miR-17及內(nèi)參U6的引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法對miR-17表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3血清VEGF水平測定 采用ELISA測定血清VEGF表達(dá)水平，在反應(yīng)板孔內(nèi)依次加入10 μl校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、待測樣品及100 μl酶標(biāo)抗體工作液，溫室搖床溫育2 h后，進(jìn)行洗板，之后加入100 μl的1×底物工作液，室溫溫育15 min，加入終止液100 μl搖勻后使用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行測定。具體操作步驟詳見VEGF ELISA試劑盒說明書，為減小誤差，待測樣品應(yīng)至少測定2次。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組一般資料比較 兩組年齡、性別、體重指數(shù)、是否吸煙、是否飲酒等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，觀察組MMSE評分顯著低于對照組(P<0.05)。見表2。

2.2兩組血清中miR-17和VEGF水平 觀察組血清miR-17和VEGF表達(dá)水平均顯著低于對照組(P<0.05)。見表3。

表2 兩組一般資料比較

表3 兩組血清中miR-17和VEGF表達(dá)水平

2.3不同程度VD患者血清中miR-17和VEGF水平 重度組血清miR-17和VEGF表達(dá)水平均顯著低于中度組和輕度組(P<0.05)；中度組血清miR-17和VEGF水平均顯著低于輕度組(P<0.05)。見表4。

表4 不同程度VD患者血清中miR-17和VEGF表達(dá)水平

與輕度組比較:1)P<0.05；與中度組比較:2)P<0.05

2.4VD患者血清中miR-17和VEGF表達(dá)水平與MMSE評分的相關(guān)性 血清miR-17和VEGF水平均與VD患者M(jìn)MSE評分呈正相關(guān)(r=0.731、0.703，P<0.05)。見圖1。

2.5VD患者血清中miR-17與VEGF表達(dá)水平的相關(guān)性 VD患者血清miR-17與VEGF表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.668，P<0.05)。見圖2。

圖1 VD患者血清中miR-17和VEGF表達(dá)水平與MMSE評分的相關(guān)性

圖2 VD患者血清中miR-17與VEGF表達(dá)水平的相關(guān)性

3 討 論

VD是世界上僅次于阿爾茨海默病的第二大癡呆類疾病，占癡呆患者總?cè)藬?shù)的18%左右〔5〕，VD被認(rèn)為是由腦組織供血供氧不足等導(dǎo)致的腦功能障礙，根據(jù)發(fā)病的形式可分為急性VD和慢性VD。其臨床表現(xiàn)為認(rèn)知功能減退、記憶障礙、情感障礙、行為異常、生活自理能力及其他社會功能下降等，嚴(yán)重威脅患者生命健康〔1〕，診斷VD患者的癡呆程度常用的評分量表有Hachinski缺血計(jì)分表、韋氏記憶量表(WMS-CR)、日常生活功能量表(ADL)、MMSE等〔6〕，臨床上這些量表可單獨(dú)使用或組合使用。其中MMSE是最常使用的反映VD患者癡呆程度的評價量表。隨著社會人口老齡化進(jìn)程的不斷加快，VD發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，給社會發(fā)展及其家庭經(jīng)濟(jì)帶來了負(fù)擔(dān)。但其具體發(fā)病機(jī)制至今仍不是很清楚。研究表明，血管病變及其他系統(tǒng)損害是VD發(fā)病的病因，且其發(fā)病過程與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切〔7〕。另外血管內(nèi)皮細(xì)胞對維持腦部內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及免疫代謝過程具有重要的作用，其代謝異常能夠使腦組織神經(jīng)細(xì)胞死亡及神經(jīng)功能紊亂，可能參與VD的疾病進(jìn)程，因此尋找能夠調(diào)節(jié)血管形成的生物標(biāo)志物來反映VD的疾病進(jìn)程，對于臨床治療VD患者具有重要意義。miRNA廣泛存在于真核生物中，能夠參與早期胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、凋亡及造血調(diào)控等生理過程，是機(jī)體內(nèi)重要的基因表達(dá)調(diào)控因子，與血管形成具有一定的關(guān)系〔8〕。miR-17是miRNA的一個家族，是由6個結(jié)構(gòu)相仿，序列相似，物種間高度保守的成熟體miRNA組成〔9〕。研究表明，miR-17在腫瘤組織中表達(dá)異常，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)血管生成的作用〔10〕。Yan等〔11〕研究表明miR-17-92在結(jié)腸癌患者體內(nèi)表達(dá)異常，miR-17-92簇高表達(dá)能夠抑制由缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，說明miR-17-92高表達(dá)可能在缺氧所致細(xì)胞凋亡中起重要作用。Kang等〔12〕研究表明miR-17家族是濾泡輔助性T細(xì)胞(TFH)分化的調(diào)節(jié)因子，通過抑制pH結(jié)構(gòu)域和富含亮氨酸重復(fù)序列的蛋白質(zhì)磷酸酶(PHLPP)2的表達(dá)，調(diào)節(jié)可誘導(dǎo)協(xié)同刺激分子(ICOS)和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的信號強(qiáng)度來控制T細(xì)胞向B細(xì)胞濾泡的遷移，在體液免疫中具有重要的調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果顯示觀察組miR-17表達(dá)水平顯著低于對照組，與VD患者M(jìn)MSE評分呈正相關(guān)，提示miR-17水平降低可能與VD發(fā)生有關(guān)。VEGF又稱作血管調(diào)理素，是對血管形成具有特異性調(diào)節(jié)的生長因子，腦缺血損傷后，血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞等均可分泌VEGF，進(jìn)而促進(jìn)血管的生長及內(nèi)皮細(xì)胞分裂〔13〕。據(jù)報(bào)道VEGF表達(dá)異常下調(diào)時可使血管修復(fù)受損，造成缺血性神經(jīng)元損傷，在組織或器官生理或病理?xiàng)l件下，VEGF能夠聯(lián)系相關(guān)信號通路，參與調(diào)節(jié)血管新生過程，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔14〕。唐慧等〔15〕研究表明雌激素能夠通過上調(diào)VEGF蛋白表達(dá)，降低大鼠腦慢性低灌注誘導(dǎo)的微血管損傷。Wang等〔16〕在VD大鼠模型中研究了骨髓單個核細(xì)胞移植對VD大鼠認(rèn)知功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)骨髓單個核細(xì)胞移植可通過增強(qiáng)血管生成，減少蛋白質(zhì)損傷，促進(jìn)大鼠的認(rèn)知恢復(fù)。研究表明，血管生成可能是由VEGF-VEGFR2信號通路上調(diào)引起。Zhang等〔17〕探究了經(jīng)顱磁刺激(rTMS)對VD大鼠學(xué)習(xí)和記憶的影響，結(jié)果表明rTMS通過上調(diào)VEGF，能夠改善VD模型大鼠的學(xué)習(xí)和記憶。本研究結(jié)果顯示觀察組VEGF表達(dá)水平顯著低于對照組，血清VEGF水平與VD患者M(jìn)MSE評分呈正相關(guān)，提示VEGF水平降低可能與VD發(fā)生有關(guān)。許曉月等〔18〕研究表明miR-17-5p可能通過調(diào)控血管形成相關(guān)基因VEGF的表達(dá)進(jìn)而影響子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病。Chamorro-Jorganes等〔19〕miR-17-92簇表達(dá)可能通過誘導(dǎo)VEGF的分泌，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生成，參與血管生成的調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果提示miR-17和VEGF水平可能參與VD疾病發(fā)展進(jìn)程。

綜上所述，miR-17和VEGF在VD患者血清中明顯下調(diào)，血清中miR-17和VEGF水平呈明顯正相關(guān)，提示二者可能與血管性癡呆疾病的發(fā)生和病情發(fā)展有關(guān)。然而，本研究僅初步探究miR-17和VEGF在VD患者血清中的表達(dá)關(guān)系，具體生物學(xué)機(jī)制仍需繼續(xù)深入研究。另外，本研究樣本例數(shù)較少，下一步準(zhǔn)備擴(kuò)大樣本容量繼續(xù)進(jìn)行深入研究，以期為VD患者的臨床治療提供一定參考依據(jù)。