基于NF-κB和Nrf2信號(hào)通路探討槲皮素的護(hù)肝功效及其作用機(jī)理

張紅娜，周玉法，劉敬博，龐全海

(1.河北經(jīng)貿(mào)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊 050061；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801； 3.泰安市岱岳區(qū)畜牧局，山東泰安 271000；4.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安 271000)

肝臟作為重要的代謝器官，在機(jī)體的免疫防御、物質(zhì)代謝以及清除體內(nèi)毒物和藥物等方面起到至關(guān)重要的作用。毒素、酒精、病原微生物以及藥物等因素都可以造成肝臟功能障礙甚至是肝細(xì)胞壞死[1-2]。目前，隨著老齡化時(shí)代的到來(lái)，人們對(duì)藥物和保健品的需求也與日俱增，但藥物和保健品的盲目使用使得藥物性肝損傷的發(fā)生率隨之增加[3]。

藥物性肝損傷不僅給患者造成嚴(yán)重的健康威脅，而且也造成醫(yī)療資源的不必要浪費(fèi)。在臨床上，由于藥物濫用造成的肝損傷已經(jīng)引起全球科研工作者的廣泛關(guān)注[4-7]。對(duì)乙酰氨基酚(Acetaminophen , APAP)，也稱撲熱息疼，過(guò)量或長(zhǎng)期服用會(huì)加劇肝臟的氧化應(yīng)激并促進(jìn)炎癥因子的過(guò)度釋放，導(dǎo)致肝功能紊亂甚至急性肝衰竭[8-9]。APAP造成的肝損傷在藥物性肝損傷中最為常見(jiàn)，具有較高的發(fā)病率和死亡率[10-11]。目前，針對(duì)APAP造成的肝損傷尚無(wú)有效藥物可用[12]。因此，開(kāi)發(fā)有效治療APAP肝損傷的藥物顯得尤為必要。

槲皮素(Quercetin, QUE) 屬于黃酮醇類物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化以及增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功效[13]。以往的很多研究表明，QUE的護(hù)肝藥效與其良好的抑制促炎因子分泌和提高機(jī)體抗氧化能力密不可分，但具體的護(hù)肝機(jī)理有待深入研究[14-17]。本研究以APAP造成的藥物性肝損傷小鼠為動(dòng)物模型，從抗炎和抗氧化兩個(gè)視角來(lái)探索其護(hù)肝機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)小鼠

選擇60只健康的BALB/c雄性小鼠，體質(zhì)量為(20±2) g，購(gòu)于山東第一醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。在整個(gè)飼養(yǎng)過(guò)程中，12 h 明/暗交替，小鼠自由采食和飲水。

1.2 藥物、試劑和儀器

氧化還原指標(biāo)檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒由南京建成生物科技有限公司提供；Western-blot檢測(cè)所用抗體由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供；QUE和APAP由山東漱玉平民大藥房提供(純度>98%)；DSX500數(shù)碼顯微鏡(日本Olympus公司)；Stat4200型全自動(dòng)酶標(biāo)儀和高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)。

1.3 動(dòng)物分組及給藥

60只小鼠隨機(jī)等分為 4 組，包括試驗(yàn)組(QUE低劑量干預(yù)組、QUE高劑量干預(yù)組和APAP肝損傷組)和對(duì)照組。根據(jù)小鼠體質(zhì)量，低、高QUE干預(yù)組連續(xù)7 d分別灌服50 mg/kg和100 mg/kg QUE溶液[二甲基亞砜(DMSO) 配制]，對(duì)照組和APAP肝損傷組灌服等量生理鹽水。第7 天灌服前禁食12 h，灌服完成1 h后，3個(gè)試驗(yàn)組腹腔注射350 mg/kg APAP溶液(0.9%氯化鈉注射液配置)，對(duì)照組注射等量生理鹽水。

1.4 樣品收集和處理

腹腔注射完成24 h后，進(jìn)行眼球采血，血液樣品靜置30 min后，4 000 r/min離心15 min，吸取上清為待測(cè)血清樣品。采血完成后，頸椎脫臼法處死小鼠，取出肝臟，從肝左葉中部橫截面取樣品置于40 g/L多聚甲醛中固定，其余部分冷凍，備用。

1.5 組織病理學(xué)檢查

肝組織進(jìn)行包埋、切片后，采用蘇木精和伊紅(H&E)進(jìn)行染色處理，經(jīng)脫水、透明和中性樹(shù)膠封固后，置于光學(xué)顯微鏡下對(duì)切片進(jìn)行圖像分析和采集。

1.6 血清生化指標(biāo)以及細(xì)胞因子指標(biāo)測(cè)定

取血清樣品，按照檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明分別測(cè)定ALT和AST的活性以及TNF-α、IL-1β和IL-10的質(zhì)量濃度。

1.7 肝組織中氧化還原指標(biāo)測(cè)定

將肝臟組織用預(yù)冷的PBS溶液進(jìn)行研磨勻漿，離心后取上清液，然后按照氧化還原指標(biāo)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)肝組織中SOD、GSH-Px的活性和MDA、GSH的質(zhì)量摩爾濃度。

1.8 Western-blot分析NF-κB p65和Nrf2的表達(dá)

提取的肝組織總蛋白用BCA檢測(cè)試劑盒測(cè)定總蛋白的質(zhì)量濃度，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，用50 g/L脫脂牛奶對(duì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上的樣品封閉1 h，然后連續(xù)洗膜3次后，用一抗孵育過(guò)夜；再次洗滌3次后，用二抗在室溫條件下孵育30 min。最后發(fā)光顯影進(jìn)行圖像采集并分析灰度值。

1.9 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用One-way analysis of variance(ANOVA)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(SPSS 15.0)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠存活率

經(jīng)腹腔注射APAP溶液或生理鹽水12 h后，對(duì)照組和QUE干預(yù)組的小鼠均未出現(xiàn)死亡，但APAP肝損傷組有2只小鼠在注射6～8 h后死亡。由此可見(jiàn)，QUE干預(yù)降低由APAP導(dǎo)致的小鼠死亡率。

2.2 肝組織的病理性損傷

由4組小鼠的完整肝臟(圖1)可看出，APAP肝損傷組的肝臟明顯腫大，顏色變深，且有黑色顆粒狀斑點(diǎn)；低劑量QUE干預(yù)組較APAP肝損傷組肝臟的顏色由黑紅色變淡，無(wú)明顯腫大；高劑量QUE干預(yù)組的肝臟外觀與對(duì)照組相似，表面有光澤且顏色較淺。

圖1 不同試驗(yàn)條件下小鼠肝臟的外觀Fig.1 Characteristics of liver morphology under different experimental conditions

由H&E染色結(jié)果(圖2) 可知，與對(duì)照組相比， APAP組肝細(xì)胞出現(xiàn)損傷，肝小葉周圍發(fā)生炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞核固縮現(xiàn)象明顯；低劑量QUE干預(yù)組小鼠肝臟的中央靜脈變性和壞死現(xiàn)象減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及細(xì)胞核固縮減少；高劑量QUE干預(yù)組與對(duì)照組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為相似，幾乎無(wú)變性及壞死現(xiàn)象。表明QUE改善APAP誘導(dǎo)的肝臟組織病理學(xué)變化，且具有量效特點(diǎn)。

圖2 H&E染色的小鼠肝組織病理切片(×200)Fig.2 Hematoxylin and eosin-stained liver section of mice from each group(×200)

2.3 QUE對(duì)APAP誘導(dǎo)肝損傷小鼠血清中ALT和AST活性的影響

為評(píng)估QUE是否對(duì)APAP造成的肝損傷有緩解作用，分析小鼠血清中ALT和AST的活性。結(jié)果顯示，QUE干預(yù)組ALT和AST的活性較肝損傷組顯著下降，且具有量效特點(diǎn)(圖3)。

2.4 QUE對(duì)肝組織中氧化還原指標(biāo)的影響

由圖4可知，QUE各劑量組SOD、GSH-Px的活性和GSH的濃度與肝損傷組相比都表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，但MDA的質(zhì)量摩爾濃度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且在高劑量QUE干預(yù)情況下差異極顯著 (P<0.01)。表明QUE能夠抑制APAP造成的氧化性肝損傷。

2.5 QUE對(duì)血清中炎癥因子的影響

與肝損傷組相比，不同劑量QUE干預(yù)組小鼠血清中TNF-α和IL-1β的質(zhì)量濃度均降低，但I(xiàn)L-10顯著升高(圖5)。表明QUE不僅能抑制促炎因子的分泌，而且還能提高抑炎因子的表達(dá)水平，具有良好的抗炎功效，且與劑量有一定的相 關(guān)性。

與對(duì)照組相比：**P<0.01；與APAP組相比： #P<0.05、##P<0.01。下同 **P<0.01 vs control group; ##P< 0.01, #P<0.05 vs APAP model group, the same below

2.6 Western-blot分析NF-κB p65和Nrf2的表達(dá)變化

通過(guò)Western-blot檢測(cè)QUE和APAP對(duì)肝臟中NF-κB p65和Nrf2蛋白表達(dá)的影響，探索QUE的護(hù)肝通路。由圖6-A看出，與對(duì)照組相比，APAP誘導(dǎo)的肝損傷引起NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯上升，Nrf2蛋白明顯下降。蛋白表達(dá)條帶的灰度值(圖6-B和6-C)可清晰顯示，與APAP組相比，高、低劑量的QUE干預(yù)顯著降低NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平，顯著上調(diào)Nrf2蛋白的表達(dá)水平，且高劑量QUE組表現(xiàn)為差異極顯著。表明QUE發(fā)揮護(hù)肝功效與其有效抑制NF-κB信號(hào)通路，減少促炎癥因子的產(chǎn)生，以及促進(jìn)Nrf2信號(hào)通路，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力密切相關(guān)(圖7)。

圖4 肝組織中SOD、GSH-Px、GSH及MDA水平Fig.4 Level of SOD, GSH-Px, GSH, and MDA in

圖5 血清中炎癥因子的質(zhì)量濃度 Fig.5 Mass fraction of inflammatory factors in

圖6 肝組織中NF-κB p65和Nrf2的蛋白表達(dá)水平Fig.6 NF-κB p65 and Nrf2 protein expression levels in

圖7 槲皮素緩解APAP造成肝損傷的可能機(jī)理圖Fig.7 Potential mechanism of quercetin for alleviating liver injury induced by APAP

3 討 論

血清中ALT和AST活性被公認(rèn)為是診斷肝臟毒性或肝損傷的重要參考生化指標(biāo)[18]。本研究中，腹腔注射APAP后，小鼠血清中ALT和AST的活性顯著升高，肝組織病理切片檢測(cè)結(jié)果顯示肝細(xì)胞出現(xiàn)變性甚至壞死以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等，說(shuō)明本研究中藥物性肝損傷小鼠模型建立成功。不同劑量QUE干預(yù)處理均能明顯降低APAP誘導(dǎo)的血清中ALT和AST的活性，減輕APAP引起的病理組織學(xué)變化。表明QUE對(duì)APAP造成的藥物性肝損傷有一定的保護(hù)作用。

APAP過(guò)量導(dǎo)致氧化應(yīng)激是小鼠肝損傷的重要原因[19]。為進(jìn)一步證實(shí)QUE通過(guò)降低氧化應(yīng)激反應(yīng)而發(fā)揮護(hù)肝效應(yīng)。本研究檢測(cè)了氧化應(yīng)激相關(guān)參數(shù)，包括MDA、GSH-Px、GSH和SOD。MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化的重要產(chǎn)物，用來(lái)評(píng)估氧化應(yīng)激的程度[20]。抗氧化劑SOD和活性氧清除劑GSH不僅可與自由基、超氧離子等結(jié)合，而且可將其催化為無(wú)害的物質(zhì)，使細(xì)胞免受氧化損傷[21]。本研究中過(guò)量的APAP會(huì)通過(guò)降低GSH的濃度、降低GSH-Px和SOD的活性，以及增加MDA的質(zhì)量摩爾濃度引起肝細(xì)胞氧化應(yīng)激，而QUE干預(yù)處理明顯降低肝組織中SOD、GSH-Px的活性和GSH濃度，抑制MDA質(zhì)量摩爾濃度的增加，且呈劑量依賴性。表明QUE可通過(guò)抗氧化活性減少肝臟的氧化應(yīng)激損傷。

本研究中，QUE干預(yù)處理可顯著下調(diào)APAP肝損傷組小鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的質(zhì)量濃度，顯著上調(diào)抑炎因子IL-10的表達(dá)，且與劑量有一定的相關(guān)性。表明QUE可通過(guò)抗炎活性來(lái)緩解APAP誘導(dǎo)所致的藥物性肝損傷。

NF-κB p65和Nrf2作為轉(zhuǎn)錄因子，分別在調(diào)控炎性細(xì)胞因子表達(dá)和機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用[22-25]。本研究利用Western-blot分析NF-κB p65、Nrf2轉(zhuǎn)錄因子在小鼠肝細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，APAP可誘導(dǎo)NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平顯著升高，QUE干預(yù)處理可使該蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，且與劑量有相關(guān)性，說(shuō)明QUE可通過(guò)抑制APAP引發(fā)的炎癥反應(yīng)緩解肝損傷，從而發(fā)揮護(hù)肝功效。與對(duì)照組相比，APAP組小鼠肝細(xì)胞中Nrf2蛋白表達(dá)顯著下降，而QUE干預(yù)組顯著上調(diào)，表明QUE可通過(guò)激活Nrf2通路提高抗氧化因子的表達(dá)，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激起到護(hù)肝效果。由此推測(cè)，QUE的護(hù)肝功效不僅與激活Nrf2信號(hào)通路，加強(qiáng)機(jī)體的抗氧化應(yīng)激水平相關(guān)，而且與抑制NF-κB 信號(hào)通路，降低促炎因子釋放密切相關(guān)。

本研究結(jié)果證實(shí)QUE能有效緩解APAP造成的藥物性肝損傷，在對(duì)APAP造成的藥物性肝損傷中發(fā)揮抗炎和抗氧化的護(hù)肝機(jī)理是分別通過(guò)調(diào)控NF-κB和Nrf2信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)，且呈現(xiàn)出量效特點(diǎn)。