蘆筍莖尖遺傳轉化體系的建立與優化

張 園，劉正杰，林 春，閆亞澤， 袁加紅，王 入，毛自朝，楊煥文

(1.云南農業大學 農學與生物技術學院,昆明 650201; 2.云南農業大學 特色小宗作物研究中心, 昆明 650201; 3.云南農業大學 煙草學院,昆明 650201)

蘆筍(AsparagusofficinalisL.)是多年生宿根性草本植物，百合科天門冬屬，學名石刁柏，屬國宴常用蔬菜，常有“蔬菜之王”美譽[1]。蘆筍除具備很高食用價值之外，還能對人體多種疾病有預防和治療效果，如降血糖、降血脂、抗癌等[2]。目前，國際蘆筍市場需求量正在日益增長，其中中國蘆筍約占國際蘆筍消耗量40%，蘆筍產業已成為蘆筍栽培產地農民增收致富重要來源[3-4]。目前，市場上所用蘆筍栽培品種雖然產量和品質較好，但多易感病害，特別是莖枯病、褐斑病和炭疽病等，因此篩選高產、高質和抗病品種是蘆筍育種工作的重點[5]。蘆筍品種以雜交育種和系統選育等常規選育方法為主，但常規選育過程長，育種流程繁瑣，可控性較差且育種效率較低；與之相比，轉基因育種能克服常規育種手段許多弊端，如可以定向遺傳改良、育種周期短且可控性較高等，因此，越來越受到育種者的重視與廣泛利用[6]。

目前，國內外對于蘆筍的研究主要集中在常規育種[5]、種植栽培與管理[7]、采后生理及貯藏技術[8]、化學成分與藥理[9]、組織培養[1]等方面，而對于蘆筍轉基因育種等相關研究較少，且不夠深入。Hernalsteens等[10]將不帶外源質粒的根癌農桿菌侵染蘆筍莖，并在轉化材料檢測到了胭脂堿和農桿菌素堿的存在，證實了應用農桿菌侵染法在轉化蘆筍中的可能性,但該研究并沒有進行含有外源質粒農桿菌的遺傳轉化，也未對轉基因材料農桿菌基因表達情況以及遺傳轉化影響因素做深入研究；Limanton-Grevet等[11]用農桿菌AGL1將uidA和nptⅡ基因轉入蘆筍胚性系。雖然上述研究實現了蘆筍轉基因，但其遺傳轉化體系效率較低且研究不夠系統。鹿志偉等[6]在前人研究基礎上，開展了農桿菌介導的蘆筍遺傳轉化影響因素研究，但該研究受體材料仍是以組織培養過程中形成的數量較少的蘆筍胚狀體為外植體，導致獲得遺傳轉化植株的群體不夠大。為解決上述蘆筍轉基因研究中存在的問題，本研究以蘆筍組織培養過程中得到的莖尖為外植體，基于瞬時表達體系分析影響農桿菌轉化的諸多參數，包括農桿菌侵染濃度、侵染時間、乙酰丁香酮(AS)濃度、共培養時間、分化篩選培養基中卡那霉素濃度及抑菌抗生素種類等。在優化的遺傳轉化參數基礎上，獲得轉基因植株，并進行PCR、GUS組織化學染色檢測和qRT-PCR分析，初步建立蘆筍莖尖遺傳轉化體系，為后續遺傳轉化研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試劑

供試受體材料為蘆筍品種‘達寶利’在MS培養基上擴繁得到的新的幼嫩莖尖。挑選狀態良好的蘆筍莖尖至預培養基(1/2 MS培養基)，置于26 ℃光照培養2 d，作為后續轉化受體材料。農桿菌EHA105菌株以及質粒載體pBI121由云南農業大學特色小宗作物研究中心保存。

卡那霉素、羧芐青霉素、乙酰丁香酮(AS)、DNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒等藥品均購自上海生物工程有限公司，DNA聚合酶、dNTPs等生化試劑購自全式金生物公司，基本培養基等購自昆明云科生物技術有限公司。

培養農桿菌的培養基為YEP(每升培養基含10 g酵母提取液、5 g胰蛋白胨、10 g NaCl和0.5 g MgSO4·7H2O，pH為7.0)。共培養基[12]為1/2 MS+ IBA 0.5 mg·L-1+ KT 0.1 mg·L-1+ 嘧啶醇 0.5 mg·L-1+ AS 150 μmol·L-1；篩選培養基[12]為1/2MS + IBA 0.5 mg·L-1+ KT 0.1 mg·L-1+ 嘧啶醇 0.5 mg·L-1+ Carb 200 mg·L-1+Kan 50 mg·L-1。莖尖抗性篩選、抗性芽的生長及生根均在上述篩選培養基中完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 轉化菌液的制備 將質粒pBI121(含GUS基因)經凍融法轉化至感受態農桿菌EHA105，涂布于YEP固體培養基，挑取單克隆進行PCR陽性鑒定，接種于5 mL的YEP液體培養基(含利福平50 mg·L-1+卡那霉素50 mg·L-1)，28 ℃ 220 r·min-1振蕩培養16～18 h，再取50 μL該菌液接種至50 mL新鮮的YEP液體培養基(含利福平50 mg·L-1+卡那霉素50 mg·L-1)，28 ℃ 220 r·min-1振蕩培養培養8 h后，6 000 r·min-1離心5 min收集菌體，用重懸培養基(MS+AS 150 μmol·L-1+30 g·L-1蔗糖)調節OD600值形成侵染液備用。

1.2.2 遺傳轉化參數的確定 在超凈工作臺上，切取0.1～0.3 cm蘆筍莖尖，置于50 mL離心管中，然后加入侵染液(含AS)浸泡蘆筍莖尖，在恒溫搖床慢速搖5～40 min，再去除菌液，在無菌濾紙上吸干莖尖表面殘留菌液，接種于共培養基，于20 ℃暗處共培養，選取部分經共培養的莖尖，進行GUS瞬時表達率統計，以確定最佳轉化 條件。

農桿菌濃度：用活化好的不同OD600值根癌農桿菌菌液(OD600分別為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0)侵染蘆筍莖尖，再接種至共培養基，置于 20 ℃暗處培養3 d。取共培養結束后的莖尖進行組織化學染色，統計GUS瞬時表達率。

農桿菌侵染時間：將根癌農桿菌調節至OD600值為0.6，侵染外植體的時間分別設定為5、10、15、20、30和40 min，侵染完成后，將受體材料接種至共培養基上置于20 ℃暗處培養3 d。取共培養結束后的莖尖進行GUS組織化學染色，統計GUS瞬時表達率。

AS濃度：向活化好的根癌農桿菌以及共培養基中分別添加AS，使AS的濃度分別為0、50、100、150和200 μmol·L-1，將農桿菌液侵染蘆筍莖尖后，再接種至共培養基并置于20 ℃暗處培養3 d。取共培養結束后的莖尖進行組織化學染色，統計GUS瞬時表達率。

共培養時間的確定：調節根癌農桿菌菌液，侵染外植體，轉移至添加AS的共培養基中分別培養2、3、4、5和6 d，取共培養結束后的莖尖進行組織化學染色，統計GUS瞬時表達率。

卡那霉素濃度:蘆筍離體莖尖經農桿菌侵染后，20 ℃黑暗處共培養3 d，然后接種于添加卡那霉素0、12.5、25、50、75及100 mg·L-1的篩選培養基，26 ℃培養15 d。每個處理培養約50個莖尖，每個處理重復3次。經篩選后統計外植體的存活率，以確定適宜的卡那霉素濃度。

抗生素類型及濃度：將根癌農桿菌在含有不同類型(頭孢霉素和羧芐青霉素)及濃度抗生素(0、50、100、150、200、250和300 mg·L-1)的YEP培養基活化培養，通過統計其OD600值并觀察其抑菌效果。

1.2.3 GUS組織化學染色 共培養后，每個處理隨機取10～20個莖尖，無菌水清洗5～6次，用無菌濾紙吸干材料表面水分，放入1.5 mL離心管中，加入GUS組織化學染色液(成分為： 1 mg·L-1X-Gluc+0.5 mmol·L-1鐵氰化鉀+0.5 mmol·L-1亞鐵氰化鉀+50 mmol·L-1Na2HPO4,30 mmol·L-1NaH2PO4+8 mmol·L-1EDTA+0.5% Triton X-100)，37 ℃恒溫過夜，再用φ=70%乙醇浸泡脫色，直到色素脫去后觀測染色情況，統計GUS瞬時表達率，以無菌水處理的未侵染的莖尖為陰性對照。GUS瞬時表達率的計算公式為：GUS瞬時表達率=顯色的組織數/檢測總組織數×100%，每個處理均重復3次。

1.2.4 轉基因抗性植株的獲得 將共培養后的莖尖，經含有羧芐青霉素(200 mg·L-1)的無菌水清洗5～6遍，用無菌濾紙吸干莖尖表面水分，置于篩選培養基(1/2 MS + IBA 0.5 mg·L-1+ KT 0.1 mg·L-1+ 嘧啶醇0.5 mg·L-1+ 羧芐青霉素200 mg·L-1+ 卡那霉素50 mg·L-1)上篩選抗性莖尖，然后將抗性莖尖繼續在篩選培養基上長芽與誘導生根，獲得轉基因抗性植株。選取部分轉基因抗性植株莖尖、莖部和根部組織，進行GUS組織化學染色的初步鑒定，方法參照“1.2.3”。

1.2.5 轉基因植株的分子鑒定 取GUS組織化學染色呈陽性的轉基因植株樣品，用CTAB法提取其DNA[13]。以質粒pBI121的DNA為陽性對照，以未轉基因蘆筍植株為陰性對照。設計新霉素磷酸轉移酶編碼基因(NPTⅡ)特異引物KanF1： 5′-CACTGAAGCGGGAAGGGACT-3′，KanR1：5′-CGATACCGTAAAGCACGAGGAA-3′，擴增片段512 bp，擴增程序：94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環； 72 ℃ 10 min。擴增產物經10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統下觀察拍照。其中，陽性率的計算公式為：陽性率=PCR陽性數目/PCR樣品總數×100%。提取轉基因與非轉基因蘆筍植株莖部的RNA，用試劑盒反轉錄成cDNA，設計引物qTUB4F1：5′-CCGATAACTTTGTC TTTGGC-3′、qTUB4R1：5′-GCAAGGATTCCA AGTATGTC -3′和qKanF1：GCAGGATCTCCTGTCATCTCAC、qKanR1：CCATGGGTCAC- GACGAGATCAT，進行上述處理樣品的定量Real-time PCR分析，每個反應設置3 次重復，目的基因的相對表達量采用2-△△Ct法進行計算。

1.3 數據處理

用Excel 2016進行數據處理與分析。 數據以“平均數±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 蘆筍莖尖遺傳轉化效率的影響因素

2.1.1 蘆筍莖尖對卡那霉素抗性 由表1可知，在篩選培養過程中，隨著卡那霉素質量濃度提高，莖尖變白直至死亡，且其存活率也逐漸減小，當質量濃度超過50 mg·L-1時，存活率在8%以下。因此，設定固體篩選培養基中卡那霉素篩選最佳質量濃度為50 mg·L-1。

表1 固體篩選培養基中卡那霉素質量濃度的確定Table 1 Determination of kanamycin mass concentration in solid screening medium

2.1.2 抑菌抗生素類型及濃度的確定 通過檢測YEP液體培養基中農桿菌EHA105的OD600值來檢測頭孢霉素(Cef)和羧芐青霉素(Carb)對農桿菌的抑制效果，由圖1可知，頭孢霉素和羧芐青霉素都有較好抑菌效果，羧芐青霉素對農桿菌EHA105生長抑制作用稍好。兩種抗生素在質量濃度200 mg·L-1以上時，基本可以完全抑制農桿菌生長，因此在農桿菌EHA105侵染蘆筍莖尖后，培養基中添加羧芐青霉素200 mg·L-1。

2.1.3 農桿菌濃度和侵染時間 由圖2可知，農桿菌EHA105濃度對蘆筍莖尖的GUS瞬時表達率影響較大。研究發現，隨著侵染液濃度升高，GUS瞬時表達率呈現先升后降的變化趨勢，當菌液濃度為OD600=0.6時，GUS瞬時表達率最高，達18.05%，之后隨著菌液濃度升高，GUS瞬時表達率反而下降，而且菌液濃度OD600=1.0時，農桿菌生長過盛，污染率過高。因此，確定侵染液最佳的根癌農桿菌濃度為OD600=0.6。侵染時間過短，農桿菌不能充分與受體材料接觸從而影響轉化率，時間過長則受體材料會附著過多農桿菌而不易脫菌。為了確定侵染時間對蘆筍莖尖GUS瞬時表達率的影響，設置了5、10、15、20、30和40 min的侵染時間。由圖3可知，隨著侵染時間的延長，GUS瞬時表達率呈現先上升而后趨于相對穩定狀態，其中在侵染時間為15 min時，GUS瞬時表達率最高，為17.14%。

圖1 頭孢霉素和羧芐青霉素對 農桿菌 EHA105生長的影響Fig.1 Effects of cefotaxime and carbenicillin on the growth of Agrobacterium tumefaciens EHA105

圖2 農桿菌菌液濃度對GUS瞬時表達率的影響Fig.2 Effects of Agrobacterium tumefaciens concentration on the rate of GUS transient expression

2.1.4 乙酰丁香酮(AS)濃度和共培養時間 乙酰丁香酮(AS)的添加對于農桿菌侵染受體材料至關重要，觀察不同AS濃度對GUS瞬時表達率的影響，結果如表2所示，當AS濃度分別為50 μmol·L-1和100 μmol·L-1時差異最明顯，當AS濃度為150 μmol·L-1時，GUS瞬時表達率最高，之后提高AS濃度反而略有下降，故AS取最適濃度為150 μmol·L-1。將受體材料蘆筍莖

圖3 農桿菌侵染時間對GUS瞬時表達的影響Fig.3 Effects of Agrobacterium tumefaciens infecting time on the rate of GUS transient expression

表2 AS濃度對莖尖GUS瞬時表達陽性率的影響
Table 2 Effects of AS concentration on therate ofGUStransient expression

乙酰丁香酮/(μmol·L-1)AcetosyringoneGUS瞬時表達率/%Transient expression rate of GUS08.23±0.54509.34±0.7610016.89±0.8115018.27±1.4420018.01±1.65

尖與根癌農桿菌共培養，觀察不同的共培養時間(2～6 d)對GUS瞬時表達率的影響，結果如圖4所示：隨著共培養時間的延長，GUS瞬時表達率呈現先升高后略有降低的趨勢，其中在共培養5 d時，GUS瞬時表達率達最高，為17.89%，其次是4 d時的 17.45%。由于共培養時間過長可能造成后續農桿菌污染，因此確定共培養時間為4 d。

2.2 轉基因植株檢測

2.2.1 轉基因體系的建立 經影響因素研究，優化蘆筍遺傳轉化體系參數：將質粒載體轉化至農桿菌EHA105，挑取經PCR鑒定的重組農桿菌單菌落搖菌，配制OD600為0.6的農桿菌侵染液(含150 μmol·L-1AS)，以蘆筍莖尖為外植體，農桿菌侵染15 min(圖5-A)，共培養4 d(圖5-B)，然后置于篩選培養基進行抗性篩選，獲得抗性莖尖(圖5-C)，抗性莖尖繼續在篩選培養基進行長芽和生根培養(圖5-D～圖5-E)，最終獲得抗性轉基因植株(圖5-F)。

2.2.2 轉基因植株GUS組織化學染色與PCR檢測 待獲得抗性轉基因植株后，進行GUS組織化學染色。結果顯示，在抗性植株莖尖、莖部、根等組織部位都能不同程度地被染成藍色(圖6-A)，而非轉基因對照不能被染色，初步說明GUS基因在抗性植株中可以穩定表達。提取抗性轉基因再生植株DNA，以非轉基因野生型材料為對照進行nptⅡ基因的PCR檢測，結果發現只有抗性轉基因植株中能擴增出目的條帶(圖6-B)，說明獲得的抗性再生材料初步鑒定為轉基因陽性植株。統計PCR初步檢測結果，發現PCR陽性率達到12.4%以上。

圖4 共培養時間對GUS瞬時表達率的影響Fig.4 Effects of co-culturetime on the rate of GUS transient expression

2.2.3 轉基因植株 qRT-PCR檢測提取轉基因植株與對照莖部組織的RNA，并反轉錄成cDNA，進行qRT-pCR鑒定，結果發現，非轉基因材料中沒有nptⅡ基因的表達，而在轉基因材料中有不同程度的表達(圖7)，說明目的基因已經成功在轉基因蘆筍中穩定表達。

A.莖尖侵染 Stem tip infection; B.共培養 Co-culture; C.抗性篩選 Resistance screening; D.抗性芽 Resistant buds; E.抗性植株生根 Rooting of resistant plants; F.抗性植株 Resistant plants

圖5 ‘達寶利’莖尖遺傳轉化體系的建立
Fig.5 Establishment of the genetic transformation system for stem tip of ‘Daboli’

3 討 論

農桿菌介導的遺傳是目前轉化效果最好的植物轉化方式之一[14-15]，因此，基于蘆筍再生體系和蘆筍莖尖的結構特點，以及遺傳轉化成本與技術等因素，本研究選擇應用較為普遍的根癌農桿菌介導的遺傳轉化。Bytebier等[16]采用農桿菌侵染愈傷組織等方式，經抗性篩選與再生獲得轉基因蘆筍，但需較長轉化周期。Bruno等[17]對3種基因型蘆筍體細胞進行農桿菌介導的遺傳轉化，獲得陽性轉基因植株，但其轉化率僅為0.6%～4%。Limanton-Grevet等[11]利用AGL1Gin農桿菌侵染5個蘆筍胚性系，建立了轉化率為 0.8%～12.8%的蘆筍轉基因體系。鹿志偉等[6]在以蘆筍胚狀體為受體材料的遺傳轉化研究中，分析了菌液濃度、AS濃度、侵染時間和共培養時間等4個因素對蘆筍轉基因效率的影響，轉化率可達18%以上。與鹿志偉等[6]相關研究相比，本研究中農桿菌侵染過程的共培養時間相同，均為4 d；但采用的農桿菌侵染最佳濃度為OD600= 0.6，最佳的AS濃度為150 μmol·L-1，侵染時間為15 min，這些差異可能是由于受體材料不同而造成的。

A:轉基因植株GUS組織化學染色 GUS histochemical staining of transgenic resistant plants.a.對照莖部 Stem of CK; b.轉基因植株莖部 Stem of transgenic plants; c.對照莖尖 Stem tip of CK; d.轉基因植株莖尖 Stem tip of transgenic plants；B:轉基因植株PCR檢測 PCR detection of transgenic plants;P.質粒陽性對照 Plasmid positive control; WT.非轉基因植株 Non-transgenic plants;T103～T109.轉基因抗性植株 Transgenic resistant plants; M.D2000 DNA ladder

圖6 轉基因抗性植株GUS組織化學染色與PCR檢測
Fig.6 GUS histochemical staining and PCR detection of transgenic resistant plants

WT.非轉基因植株 Non-transgenic plants;T103～T109.轉基因抗性植株 Transgenic plants

圖7 轉基因植株qRT-PCR檢測
Fig.7 qRT-PCR detection of transgenic plants

在共培養結束后，需將受體材料轉移至篩選培養基進行抗性篩選，從而獲得具有抗性的轉化材料，因此需要確定抗性植株的抗生素濃度[18-20]。培養基中添加的抗生素濃度過高則很難獲得轉基因植株，給遺傳轉化體系的建立帶來困難；抗生素濃度過低，則會造成假陽性率過高，增加后續篩選鑒定工作，本研究通過比較莖尖在含不同濃度卡那霉素培養室上的存活率及GUS瞬時表達率發現，篩選最佳濃度為50 mg·L-1。此外，在農桿菌侵染莖尖后續抗性篩選過程中，抑制農桿菌過度生長是建立轉基因體系的關鍵因素之一，需要選擇合適的抗生素和使用濃度，本研究選擇羧芐青霉素200 mg·L-1，雖然更高的濃度對抑菌效果會更好，但也會影響莖尖的存活與生長，因此抑菌抗生素需要選擇比較適中的濃度。

由于蘆筍遺傳轉化方面的研究報道相對較少，且蘆筍遺傳轉化的效率與其他物種一樣，受多個因素的影響[21-22]，因此建立蘆筍穩定的遺傳轉化體系并不容易。本研究嘗試以蘆筍再生體系建立過程中較為常見且數量較多的莖尖為外植體，探討影響蘆筍莖尖遺傳轉化的不同影響因素，建立了穩定的遺傳轉化體系，拓展了蘆筍遺傳轉化受體類型，為后續蘆筍功能基因驗證提供研究 平臺。