交鏈格孢菌EST-SSR信息分析與分子標記通用性評價

丁換云，魏迎鳳，陳小飛

(塔里木大學 植物科學學院，新疆阿拉爾 843300)

鏈格孢屬真菌是一類極為常見的真菌，在自然界中分布較廣，對生態環境和基質的適應性強，既是重要的植物病原菌又是人和動物的條件致病菌，同時又是非常有應用潛力的生物資源。目前已發現的鏈格孢菌有近500種，并且每年都有很多新種被陸續報道，只有對其進行正確分類，才能更好地對其進行研究和利用[1]。鏈格孢屬真菌種內形態變異性較大，并且不同生物學性狀和不同地理分布的菌株致病力差異也很大[2]。因此，開發出可用于鏈格孢菌分類鑒定和遺傳多樣性分析的分子標記，具有十分重要的理論和實踐意義。

近年來，已有多種分子標記應用于鏈格孢菌遺傳多樣性研究。姚亮亮[3]運用RAPD和AFLP技術研究黑龍江省鏈格孢屬真菌遺傳多樣性，發現真菌RAPD組群與寄主植物和分離地區之間沒有相關性，而AFLP組群與寄主植物之間有一定相關性，但與分離地區之間沒有相關性。祖艷青[4]運用ISSR和RAPD標記技術研究河南省煙草赤星病菌及內生鏈格孢菌的遺傳多樣性，發現兩種標記均能檢測出煙草赤星病菌及相關鏈格孢菌株的遺傳多樣性。Paul等[5]運用RAPD技術對來自加利福利亞導致番茄壞死的69個A.alternata菌株進行研究，發現可以將菌株劃分為兩個RAPD組群，且各組群與地理來源沒有關聯。

A.alternata的近緣種A.tenuissima也是一種對農業生產危害較大的植物病原真菌，常引起多種植物病害[6-8]。黎妍妍等[9]對A.tenuissima等4種鏈格孢屬真菌進行生物學特性研究，發現4種鏈格孢菌存在著致病性差異。朱海霞等[10]研究A.tenuissima對闊葉雜草的致病性，發現該菌對豬秧秧、藜致病效果突出。然而至今，國內外依然未見有關鏈格孢菌EST-SSR方面的研究 報道。

本研究運用生物信息學方法，從NCBI數據庫中已公布的A.alternataEST序列中篩選SSR，分析其在A.alternata轉錄組中的分布特點，在此基礎上設計A.alternataEST-SSR引物，分析其在近緣種A.tenuissima中的有效性、多態性和通用性，以期為深入開展鏈格孢菌分類學、比較基因組學以及功能基因組研究提供科學的依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試菌株：細極鏈格孢A.tenuissima分離于新疆維吾爾自治區不同地區不同寄主，共38株。其中從梨黑斑病樣本分離到5菌株，包括阿拉爾市2株，民豐縣1株，尉犁縣1株，洛浦縣1株；從蘋果褐斑病樣本中分離到12菌株，其中疏勒縣3株，葉城縣3株，皮山縣2株，阿拉爾2株，阿克陶縣2株；從沙棗黑斑病樣本分離到13株，其中烏魯木齊5株，庫爾勒3株，民豐縣3株，阿拉爾三棵樹村1株，第一師五團1株；從杏黑斑病樣本上分離到4株，其中阿拉爾3株，策勒縣1株；從新和縣核桃鏈格孢葉斑病樣本分離到4株。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g，定容至1 L。

試劑及儀器：Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(真菌)、2×SanTaqPCR Mix、Sterilized ddH2O、DNA Marker D、Ready-to-use、6×loadingbuffer、15% ficoll、Agarose B，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Mastercycler pro梯度PCR儀、熒光和化學發光凝膠成像分析系統，購自美國Bio-Rad公司；DYY-12型電泳儀，購自北京六一生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1A.alternataEST-SSR信息分析 從NCBI的EST數據庫下載A.alternata的EST序列，運用軟件Phred (http://www.phrap.org/consed/consed.html#howToGet)除去長度小于100 bp的序列，運用軟件Phrap(http://www.phrap.org/consed/consed.html#howToGet)除去載體序列及重復序列，然后拼接得到較高質量的EST序列，最后運用SSRHunter 1.3軟件結合人工查找，對A.alternata的EST序列中的SSR位點進行檢測。檢測標準為：含二堿基、三堿基、四堿基、五堿基、六堿基，并且重復基元長度大于等于12 bp(二堿基重復次數≥6次、三堿基重復次數≥4次、四堿基重復次數≥3次、五堿基重復次數≥3次、六堿基重復次數≥3次)。對檢測出的SSR頻率與長度進行統計分析[11]。

1.2.2A.alternataEST-SSR引物設計 采用Primer Premier 5.0 軟件，根據EST序列中SSR兩端保守序列設計A.alternataEST-SSR引物，所選擇的EST-SSR序列兩端分別距離5′和3′端應不少于20 bp。引物設計時主要參數為：引物長度18～25 bp，GC含量40%～60%，退火溫度(Tm值)為50～65 ℃，PCR擴增長度應為100～500 bp，引物應盡量避免二級結構、發卡結構以及錯配的出現。每條引物的評分均高于85分。引物設計好后由生工生物工程(上海)有限公司 合成。

1.2.3A.alternataDNA提取與引物檢測 將保存的A.alternata菌種接種至PDA培養基上，置于27 ℃培養箱中培養，待氣生菌絲生長至快滿皿時，將菌絲刮下置入滅菌的研缽，烘干后備用。采用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(真菌)提取DNA。

PCR擴增體系為25 μL反應體系，包括2× SanTaqPCR Mix 12.5 μL、Sterilized ddH2O 10 μL、DNA模板0.5 μL、上下游引物各1 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，50～65 ℃(隨引物而設置)退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個循環；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物先用20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測，有擴增產物的樣品采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染顯色法檢測產物條帶的多態性。

2 結果與分析

2.1 A.alternata EST-SSR的組成及分布特征

2018年12月28日，從NCBI數據庫中搜索出A.alternataEST序列共727條，經去冗除雜最后拼接得到298條Unigenes，包括84條Contigs和214條Singletons。運用軟件檢測出SSR位點共34個，位點數占全部EST序列4.68%，占到Unigenes 11.41%，表明SSR在A.alternata中含量十分豐富。在298條Unigenes中，含有SSR位點的Unigenes 有26條，占全部Unigenes的8.72%；其中只含1個SSR位點的有21條，占80.77%，出現2個SSR位點的有4條，占 15.38%，含5個SSR位點的只有1條，占 3.85%。

在A.alternataEST-SSR中，二、三、四、五、六核苷酸重復基元類型分別為3、7、8、2、2種，分別占總類型的13.64%、31.82%、36.36%、 9.09%、9.09%，核苷酸重復基元類型共有22種，其中四核苷酸基元類型最多，而五、六核苷酸基元類型最少。檢測到SSR總數量為34個，其中二、三、四、五、六核苷酸重復基元的SSR數量分別為10、9、11、2、2個，分別占總SSR的29.41%、 26.47%、32.35%、5.88%、5.88%。在所有核苷酸基元類型中，二核苷酸基元類型(GA/TC)n出現頻率最高，為2.35%(表1)。

表1 A.alternata EST中重復基元及其比例Table 1 The motifs and their percentages in A.alternata ESTs

2.2 EST-SSR引物通用性檢測

根據拼接整理好的298條Unigenes序列，共設計13對EST-SSR引物(表2)，然后對來自新疆不同地區不同寄主的38個A.tenuissima進行PCR擴增。結果表明除4對引物(con36、con59、con66、sin18)未產生擴增產物外，其他9對引物均擴增出與預期片段大小一致的條帶，有效擴增效率為69.23%。而在9對引物中除4對引物(con14、sin34、sin104、sin168)只能擴增出單一條帶，其余5對(con78、con80、sin94、sin109、sin153)均能擴增出多態性條帶(圖1，圖2)，擴增多態率為55.56%，說明這5對引物在近緣種中具有通用性。

表2 設計合成的13對EST-SSR引物Table 2 Thirteen pairs of EST-SSR primers were designed and synthesized

1-2.LALAR; 3.LMF; 4.LWL; 5.LLPX; 6-8.PSLX; 9-11.PYCX; 12-13.PPS; 14-15.PALAR; 16-17.PAKT; M.Maker; 19-23.SWLMQ; 24-26.SKRL; 27-29.SMF;30.SSKS; 31.SWT; 32-34.HXH; 35-37.XALAR; 38.XCL

圖1 引物con78在38個細極鏈格孢菌中的擴增結果
Fig.1 Amplification result of 38A.tenuissimaEST-SSR markers by primers of con78

1-2.LALAR; 3.LMF; 4.LWL; 5.LLPX; 6-8.PSLX; 9-11.PYCX; 12-13.PPS; 14-15.PALAR; 16-17.PAKT; M.Maker; 19-23.SWLMQ; 24-26.SKRL; 27-29.SMF;30.SSKS; 31.SWT; 32-34.HXH; 35-37.XALAR; 38.XCL

圖2 引物sin94在38個細極鏈格孢菌中的擴增結果
Fig.2 Amplification result of 38A.tenuissimaEST-SSR markers by primers of sin94

3 結論與討論

本研究對727條A.alternataEST進行篩選除冗和拼接，得到298個片段，共發掘出34個SSR位點，平均5.343 kb含有1個SSR位點。而在其他真菌中，香菇的EST序列平均每 25.942 kb含有1個SSR位點[12]，大豆疫霉菌的EST序列平均每8.9 kb含有1個SSR位點[13]，這表明交鏈格孢菌中SSR出現頻率較高，SSR含量豐富。本研究共檢測出22種重復基元類型，其中出現頻率最高的是(GA/TC)n基元類型，以四核苷酸基元種類最多，而五、六核苷酸基元種類 較少。

隨著植物病原菌基因組研究的發展，很多植物病原菌的EST已被開發，從EST數據庫中挖掘SSR分子標記，為植物病原菌SSR標記的發展提供了一條便利途徑。SSR一般含有2～5個等位位點，在植物病原菌研究中不僅用于種群遺傳多樣性、近緣種的比較及系譜研究[14-15],而且還可以用于不同寄主分離物之間的比較[16-17]。在種內檢測多態性水平上，EST-SSR標記檢測水平要低于其他一些從非編碼區分離的標記，然而EST-SSR標記檢測的是基因組表達部分的變異，是真正與性狀連鎖的標記，這將可能對決定重要表型性狀的等位基因進行直接鑒定。另外，EST-SSR分子標記一般具有很好的通用性，一旦開發便可以在近緣種(屬)中進行應用[18]。一般情況下，同屬不同種植物間EST-SSR引物擴增成功率為50%～100%[19]。不同種真菌間的擴增成功率為 34%[20]。Kumar等[21]研究發現70%的尖鐮孢菌EST-SSR引物能在潮濕鐮孢菌中通用；Dracatos等[22]研究黑麥冠銹菌EST-SSR引物對6種真菌的通用性，發現擴增的成功率達到 22%～53%。由于真菌EST數據庫資源有限，很多學者便以真菌近緣種的EST數據資源，開發可用于真菌本身分類鑒定與遺傳多樣性的分子標記。如許韜等[23]從大麥白粉菌EST數據庫開發小麥白粉菌的SSR分子標記，效果比較理想。李新鳳等[24]開發尖鐮孢菌EST-SSR分子標記，并在近緣鐮孢菌種中進行通用性檢測，結果表明基于尖鐮孢EST序列開發鐮孢菌通用SSR標記是可行的。

本研究利用A.alternataEST數據庫，開發設計13對SSR引物中，通用性檢測表明共有9對引物能夠在A.tenuissima種內有效擴增，而具有多態性引物就有5對，這表明在不同A.tenuissima菌株間存在著遺傳分化，同時也說明基于A.alternata開發的EST-SSR引物，完全適用于研究A.tenuissima的遺傳多樣性。因此A.alternataEST-SSR分子標記的開發，為該菌近緣種A.tenuissima的鑒別、遺傳變異等研究提供重要的標記資源，為進一步研究A.tenuissima的群體遺傳學、分子生物學、分子流行學打下堅實 基礎。