碳酸酐酶1在非小細胞肺癌早期發病中作用機制的研究*

王冬濱 李璇 夏洪剛 朱德清 孫忠義

肺癌作為世界首要的腫瘤相關致死疾病，每年約造成170 萬患者死亡。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌發病率的80%～85%，主要包括腺癌和鱗癌。雖然近年來肺癌的診治水平較前有了顯著的提升，但肺癌的預后依舊較差，5年生存率較低［1］。

碳酸酐酶1（carbonic anhydrase 1，CA1）屬于碳酸酐酶家族，位于紅細胞、胃腸道、心臟組織等細胞胞漿中。CA產生的碳酸氫鹽的跨膜運輸對細胞的pH調節有重要作用，它可逆地催化CO2的水合形成HCO3-，然后迅速與鈣離子結合形成碳酸鈣。近年來研究發現，CA參與多種癌癥（如NSCLC、惡性血液病、消化道腫瘤、腎癌及腦膠質瘤等）的發生和發展，且其表達量與癌癥細胞的侵襲和轉移以及癌癥患者手術預后效果及總生存率密切相關［2］。

因此，本研究檢測了CA1 在早期NSCLC 患者血清中的表達水平，在此基礎上，進一步采用細胞模型驗證CA1 對于肺癌細胞增殖的影響，為評估CA1 作為新型NSCLC早期腫瘤標志物的效果及潛在治療靶點提供相應的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 實驗組納入2017年1月至2019年1月在天津醫院接受手術或活檢，并經過兩位病理學專家進行獨立病理學檢查證實的Ⅰ期初治NSCLC患者，共計76例。入組條件：①取血前未接受化放療等抗腫瘤治療；②如既往有惡性腫瘤，需經治療并復查5年以上，無復發轉移達到臨床治愈標準。健康對照組共計70 例，需經體檢證實無呼吸系統疾病及其他部位惡性腫瘤，與NSCLC組年齡、性別等基線數據進行匹配。

此項研究獲得天津醫院倫理審查委員會的批準。并告知患者標本的實驗目的及用途，同時簽署知情同意書。

1.1.2 試劑 Human CA1 PicoKine ELISA Kit 試劑盒購自中國武漢博士德生物工程有限公司，RPIM 1640以及胎牛血清購自中國北京HyClone公司，胰酶細胞消化液（0.25%）、Western blot 及IP 細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、CCK-8 試劑盒和MTT 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購自中國碧云天生物技術有限公司，RNAiso Plus購自中國寶日醫生物技術（北京）有限公司，M-MLV-Reverse Transcriptase 和Lipofectamine 2000 Transfection Reagent 購自美國Thermo-Fisher Scientific 公司，BrightGreen 2×qPCR Master-Mix-ROX 購自加拿大ABM 公司，CA1（ab109755）、Wnt3a（ab219412）、β-catenin（ab184919）抗體購自英國Abcam 公司。HRP Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）購自中國武漢埃博泰克生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 血液樣本的獲取 取各組研究對象清晨空腹的肘正中靜脈血（血液經過促凝處理）5 mL（實驗組于手術或活檢前取血），4℃靜置1 h，經離心（1 000×g，10 min）后吸取血清，分裝置于-80℃冰箱凍存備用。

1.2.2 酶聯免疫吸附實驗 酶聯免疫吸附實驗采用中國武漢博士德生物工程有限公司Human CA1 Pico-Kine ELISA Kit 試劑盒進行檢測，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.3 細胞培養及細胞轉染 A549、H520、H1299細胞系購自購自美國ATCC。細胞培養于37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱中，采用含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的RPIM 1640培養基，每2天換液1次。取對數期的細胞放置在六孔板中，細胞數量為每孔5×104，待細胞增至70%時，應用Lipofectamine 2000 Transfection Reagent 對細胞進行轉染，轉染過程嚴格按照試劑說明書進行操作。

1.2.4 慢病毒包裝及轉染 慢病毒包裝由中國北京合生基因科技有限公司完成，shRNA序列為：GATCC CCATCATTTCTTCTAGTGTAGCCGCTGGTTCAAG，轉染步驟遵循產品說明書進行操作。

1.2.5 質粒構建和轉染 CA1 及空白質粒的設計和構建由中國上海吉凱基因科技有限公司完成。應用Lipofectamine 2000 Transfection Reagent 及質粒構建RFect/DNA 復合物。取對數期的細胞放置在六孔板中，細胞數量為每孔5×104，待細胞增殖至80%時，應用無血清的培養基加入構建好的復合物，培養48 h。

將未做質粒轉染的細胞作為NC 組；將轉染亂序siRNA 質粒的細胞作為Scramble 組；將轉染CA1 siRNA的細胞作為sh-CA1組；將轉染空白質粒的細胞作為Mock-vector 組；將轉染過表達CA1 質粒細胞作為CA1組。

1.2.6 實時定量PCR 按照RNAiso Plus試劑說明書提取細胞總RNA。經NanodropTM2000 分光光度計檢測A260/280 比值，確定RNA 純度及濃度，采用RNA電泳檢測RNA 完整性。依據M-MLV-Reverse 逆轉錄酶說明書，進行RNA 逆轉錄。采用BrightGreen 2×qPCR MasterMix-ROX 在ABI 7500 實時熒光定量PCR 系統檢測基因表達水平。PCR 反應條件為50℃2 min；95℃5 min；95℃15 s，60℃40 s，40個循環。采用2-ΔΔCt法計算基因mRNA 表達水平。每個樣品采用3 個復孔，實驗重復3 次。本實驗所采用的引物序列見表1。

表1 實時定量PCR引物序列

1.2.7 Western blot 收集3×106個細胞，采用Western及IP 細胞裂解液提取總蛋白后，應用BCA 法進行蛋白定量，加入SDS-PAGE 蛋白緩沖液，充分混勻后至100℃金屬浴變性。取30 μg 變性后的樣品，80 V 電泳2 h、120 V轉膜80 min后，采用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入對應一抗（1:1 000稀釋）4℃過夜，隔日應用TBST洗膜3次，10 min/次。加入二抗室溫孵育1 h后，采用增強化學發光液檢測，采用BIO-RAD Chemi-Doc XRS凝膠成像系統進行記錄拍照。

1.2.8 細胞增殖實驗 CCK-8實驗采用CCK-8試劑盒嚴格按照說明書進行操作。

1.3 統計學分析

采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析。數據采用±s表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Ⅰ期NSCLC患者血清中CA1表達水平明顯增高

酶聯免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）結果示：Ⅰ期初治NSCLC患者血清中CA1 濃度為（3.65±2.05）ng/mL，健康對照組為（1.96±1.15）ng/mL。與健康人血清樣本相比，NSCLC患者血清中CA1含量明顯升高（P＜0.01，圖1、表2）。

圖1 NSCLC患者血清中CA1濃度與健康人血清樣本檢測結果

2.2 CA1表達水平與肺癌細胞增殖活性呈正相關

在A549、H520、H1299 細胞系中，應用shRNA 抑制CA1 表達后，細胞中CA1 的蛋白質和mRNA 表達水平較NC 組以及Scramble 組顯著降低（均P＜0.01）；過表達CA1 組的CA1 蛋白和mRNA 表達水平遠顯著高于對照組Mock-vector（均P＜0.01，圖2，3）。CCK8結果顯示（圖4）：抑制CA1 表達后，A549 細胞的活性為43.09%±7.57%，較NC 組（99.75%±0.5%）和Scramble 組（97.27%±1.24%）顯著降低（均P＜0.01）；敲低CA1 后，H520 細胞（34.84%±4.95%）和H1299 細胞（36.41%±5.35%）的增殖活性也較NC 組（100.08%±2.35%，100.03%±1.08%）及Scramble 組（93.6%±4.196%，96.33%±1.28%）顯著降低（均P＜0.01）。同時，轉染CA1 質粒的CA1 組中，A549、H520 和H1299的細胞增殖活性分別為130.86%±11.44%、135.59%±13.65%及123.04%±13.55%，遠高于對應的Mock-vector 組（92.77%±7.59%、91.68%±4.96%、95.56%±4.12%，均P＜0.01）。

表2 NSCLC患者與健康人血清樣本中CA1濃度

圖2 A549、H520和H1299不同處理組中CA1 mRNA表達水平

圖3 A549、H520和H1299不同處理組中CA1蛋白表達水平

圖4 A549、H520和H1299不同處理組的細胞活性

2.3 CA1對WNT/β-catenin信號通路的影響

實時定量PCR 及Western blot 結果顯示（圖5～7）：在A549、H520和H1299細胞中，應用shRNA敲低細胞中CA1 后，WNT 信號通路中的Wnt3a 和βcatenin 的mRNA 及蛋白的表達水平顯著降低（均P＜0.01），而過表達CA1 組相較于對照組Mock-vector，Wnt3a及β-catenin表達水平顯著升高（均P＜0.01）。

圖5 A549、H520和H1299不同處理組中Wnt3a mRNA表達水平

圖6 A549、H520和H1299不同處理組中β-catenin mRNA表達水平

圖7 A549、H520 和H1299 不同處理組中Wnt3a 和β-catenin 蛋白表達水平

3 討論

本研究通過對Ⅰ期NSCLC 患者血清進行ELISA檢測，發現CA1 在Ⅰ期初治NSCLC 患者血清中表達水平上調。為了進一步研究CA1在NSCLC疾病進展中的作用，采用RNAi技術干擾A549、H520、H1299細胞中CA1 的表達，研究表明：CA1 對A549、H520、H1299 細胞的增殖起到了促進作用，并且對WNT/βcatenin信號通路起到了正向調節作用。

肺癌已經成為中國癌癥死因之首，同時肺癌發病率及死亡率也呈現逐年上升的趨勢［1］。肺癌的早期篩查對于患者的診斷和治療尤為重要，隨著細胞分子生物學和基因學的發展，研究發現多種基因突變與NSCLC的發生及發展有著密切的關系，如BRAF V600E、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、程序性死亡受體-配體1（programmed death-ligand 1，PDL1）等［3-5］，這些基因的發現為NSCLC的治療提供了非常重要的靶點，顯著地提升了患者的生存質量和生存率。而對于NSCLC的診斷和早期篩查，目前依然主要依靠CT和痰液細胞學檢查，缺乏特異的分子生物學標記物。有研究指出，NSCLC發病早期，循環腫瘤細胞（ctDNA）、miRNA及DNA甲基化水平會發生一定的改變，這些變化指標有可能成為腫瘤早期診斷及篩查的生物標志物［6-7］。

CA在人體內的主要作用為催化二氧化碳和碳酸的化學反應,其在肺部、胃腸道、神經系統、腎臟等多種臟器中均有表達［8］。研究表明，CA在腫瘤的生存、增殖、代謝、轉移和侵襲過程中發揮重要作用，促使CA1成為新的研究熱點［9-13］。本研究通過對臨床樣本進行檢測，發現CA1 在早期NSCLC 患者血清中明顯增高，提示CA1 有可能成為一種新型的NSCLC 早期篩查的生物標志物。

Wnt/β-catenin 信號通路在腫瘤的增殖、轉移、上皮至間質轉化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）等過程中發揮重要的調節作用［14］。在NSCLC發病過程中，Wnt/β-catenin 信號通路被激活從而導致NSCLC腫瘤病程進展加速［15］。β-catenin作為Wnt/β-catenin 信號通路重要的下游效應因子，其可以激活包括c-Myc、cyclin D1、c-Jun 等原癌基因的表達［16］。本課題研究發現，在NSCLC 細胞系A549、H520 及H1299 中，抑制CA1 的表達，可使Wnt/βcatenin信號通路中Wnt3a及β-catenin 表達水平發生下調，反之過表達CA1 能夠促進Wnt3a 及β-catenin表達。研究結果提示CA1能夠通過Wnt/β-catenin信號通路對NSCLC的進展進行調節。

綜上所述，CA1 的表達與NSCLC 細胞的增殖速率呈正相關，提示其在肺癌的發生和發展中有促進作用。CA1 在NSCLC 中的作用機制有待進一步研究，從而更好地印證CA1 能夠作為NSCLC 早期診斷的生物標記物及臨床治療的潛在靶點。