基于網絡藥理學的連翹治療腎小球腎炎潛在靶點的研究

陳璟 聶銳 單鑫 陳靜 汪潔 呂志陽

摘 要：基于網絡藥理學方法研究連翹治療腎小球腎炎潛在靶點。采用中藥系統藥理學數據庫及技術平臺（TCMSP）按照口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18篩選出連翹的活性成分及其作用靶點，通過Uniprot數據庫找出官方基因名稱。利用Genecards數據庫檢索與腎小球腎炎相關的靶點基因。將活性成分所對應的基因靶點與腎小球腎炎相關靶點基因交集，獲得兩者的共同基因即為連翹治療腎小球腎炎的關鍵靶點。用Cytoscape軟件構建中藥-活性成分-關鍵靶點網絡。將關鍵靶點導入String數據庫獲得蛋白質互作關系，結果導入Cytoscape軟件進行可視化。利用DAVID數據庫及ClueGo插件對關鍵作用靶點進行GO注釋分析和KEGG通路分析，進而探究連翹治療腎小球腎炎的生物過程及作用通路。篩選得到連翹24個活性成分及478個潛在作用靶點，其中與腎小球腎炎重復的有217個關鍵靶點。通過網絡藥理學預測連翹防治腎小球腎炎的關鍵靶點及其相關信號通路，推測該方劑對腎小球腎炎的潛在作用機制，為闡明中藥治療腎小球腎炎提供了科學依據。

關鍵詞：連翹；腎小球腎炎；網絡藥理學；關鍵靶點

基金項目：國家自然科學基金（81073111，81374029，81874359）；江蘇省自然科學基金（BK20161371）；江蘇省高校自然基金（18KJB36011）；江蘇省高校自然科學研究面上項目（18KJB310012）；2019江蘇省中醫藥管理局項目（YB201997）

腎小球腎炎（acute glomerulonephritis，AGN）在臨床上為常見疾病之一，多數因為鏈球菌和其他細菌感染，其臨床表現為水腫、高血壓、血尿、蛋白尿。西醫一般會采用抗菌、抗感染、抗過敏等治療措施[1]，但是這些藥物會對腎臟造成巨大的毒副作用。在現代醫學看來，AGN的發病機制比較復雜，治療需要結合臨床單方驗方及中成藥，臨床效果顯著。目前臨床在治療AGN時，主要采用攻補兼施的治法，虛多于實，則先補后攻。

在中醫的認知中，AGN屬于“水腫”等陽水范疇，其發病機制與外邪侵襲密切相關，致使肺、脾、腎三臟功能嚴重失調，水液代謝出現異常[2]?！夺t宗金鑒》所說：“風水得之，內有水氣，外感風邪；皮水得之，內有水氣，皮受濕邪。”明代戴思恭《證治要訣》曰：“有患實多于虛，則先攻后補。生瘡，用于瘡藥太早，致遍身腫。因此，治療AGN需要將利水除濕、祛風清熱作為治療原則[3]。連翹可以疏散風熱，清熱解毒，可以治療AGN所導致的熱毒。但是在一般研究中，都是將連翹用于麻黃連翹赤小豆湯作為整體治療AGN。本研究將單獨探索連翹治療AGN的潛在作用機制。

中藥的成分相當復雜，以往的研究模式很難說清其潛在作用機制。因而運用網絡藥理學研究方式解析中藥及其復方中單一組分的分子作用機制。本研究以連翹為切入點，通過網絡藥理學的方法篩選連翹的活性成分及作用靶點，檢索已知的AGN相關靶點，利用用于注釋、可視化和集成發現的數據庫（the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID）及ClueGo分析探究連翹治療AGN的潛在作用機制，為臨床治療AGN提供新思路。

1 材料與方法

1.1 連翹活性成分的篩選

采用中藥系統藥理學數據庫及技術平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database And Analysis Platform，TCMSP）篩選出已知的連翹活性成分。可以選擇具有良好類藥性和毒藥物動力學的吸收、分布、代謝和排泄（Absorption-Distribution-MetabolismExcretion，ADME）特征的化合物用于進一步研究。連翹在臨床上一般用作湯劑，便于口服。按照口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug-Like，DL）≥0.18進行篩選得出連翹有效活性成分，記錄備用。

1.2 構建有效活性成分-作用靶點

經過TCMSP所得到的有效成分及其相關靶點，通過Uniprot數據庫找出相應的官方基因名稱，篩選出人類的基因靶點名稱，將數據導入Excel中，就得到了連翹有效成分—基因靶點。之后，利用Cytoscape 3.7.0軟件構建“藥物活性成分-基因靶點”網絡圖，其中藥物的活性成分與其作用的靶點會形成一個節點，而藥物活性成分與其相應靶點的連線則為節點的度值（Degree）。

1.3 AGN疾病靶點的收集

采用GeneCards數據庫收集AGN的疾病靶點，將數據收集到Excel中。

1.4 關鍵靶點的GO注釋及KEGG通路福集

采用DAVID數據庫對關鍵作用靶點進行GO注釋分析，將篩選條件設置為細胞的組成（cellular component）、分子的功能（molecular function）和生物的過程（biological process）3個篩選條件，點擊“Functional Annotation Table”，得到GO注釋結果。利用 Cytoscape 3.7.0 軟件中的ClueGo插件對關鍵作用靶點進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes，KEGG）通路分析，將關鍵作用靶點輸入到“GENES”一欄，選擇物種為人類，再設定P<0.05，選擇KEGG通路，最后點擊“start”開始分析，得到連翹對治療AGN的潛在作用通路。

2 結果

2.1 連翹-有效成分-靶點

通過TMCSP數據庫收集24個有效成分及其516個基因靶點，最后得到477個有效基因靶點。用Cytoscape 3.7.0軟件進行可視化構建“活性成分-作用靶點”網絡圖（見圖1）。其中按度值排名前10的有PTGS2、SCN5A、ADRB2、NCOA2、PTGS1、CALM、F10、KCNH2、HSP90、PPARG，這些靶點是連翹發揮作用的中藥靶點。

2.2 關鍵靶點的生物功能預測及作用通路分析

對關鍵靶點基因進行GO富集分析，通過ClueGo插件對關鍵靶點進行分析。網絡中的關鍵靶點通過調控DNA重組，調節蘇氨酸激酶活性，激活MAPK活性，使其在血管生成、血管發育、核心啟動特異性DNA結合的環節發揮作用。

采用Cytoscape中的插件ClueGO來對關鍵靶點進行通路富集分析。關鍵靶點主要集中在白細胞介素17（IL-17）信號通路、Cancer信號通路、Tuberculosis信號通路、Toll-like receptor等信號通路。

3 討論

AGN的發病率逐年上升，現代分子學研究表明，不同信號通路及其相關蛋白、基因參與調控該疾病的發生與發展，相互作用機制復雜，單純通過使用“點對點”的藥物干預方式，很難改善AGN，臨床效果較差。所以本研究將目光轉移到傳統的中藥復方上。

通過網絡藥理學方法對連翹進行研究，最終找到了24個活性成分，預測了478個潛在靶點。在“活性成分-靶點”網絡圖中quercetin（槲皮素）、kaempferol（山奈酚）等活性成分可作用于多個靶點，槲皮素的活性較強，具有很好的抗炎作用，有效緩解AGN的發生發展。在對靶點的預測過程中，發現PTGS2、SCN5A等靶點可作用于多個活性成分，這體現了中藥多成分協同作用的特點。通過GeneCards平臺收集AGN相關靶點基因，與活性成分作用靶點取交集后最終獲得217個關鍵靶點基因。其中NOS2、CDK2、BAX、NF-kB、EGF、PTGS1、PIK3CG、KDR、PCNA、ELK1這10個關鍵靶點在治療疾病方面具有重要的作用。這些發現不僅加深了研究人員對疾病發病機制的認識，還為治療這種疾病提供了新的策略。

在GO富集分析結果中，發現預測的關鍵靶點主要通過調控DNA重組，調節蘇氨酸激酶活性，激活MAPK活性，使其在血管生成、血管發育、核心啟動特異性DNA結合的環節發揮作用。在KEGG通路分析結果中，發現預測的關鍵靶點主要集中作用在白細胞介素17（IL-17）、Cancer、Tuberculosis、Toll-like receptor等信號通路。這些通路主要在氧化應激、炎癥等方面具有良好的作用，并且上述通路與目前相關研究結果具有一致性，證明本研究預測出的結果具有可靠性，主要表現在：（1）白細胞介素17（IL-17）信號通路：IL-17介導了一些炎性疾病，IL-17在腎臟中免疫復合物沉積后促進AGN。（2）Toll樣受體信號通路：抑制Toll樣受體信號傳導，這可能導致先天免疫反應的損傷，是導致AGN的重要因素之一。

4 結語

通過網絡藥理學，預測連翹防治AGN的關鍵靶點及其相關信號通路，推測該藥對疾病的潛在作用機制，可能主要參與抗炎、調節免疫及氧化應激等過程，為闡明中藥治療AGN的作用機制提供了科學依據。

[參考文獻]

[1] 劉陽.麻黃連翹赤小豆湯加減治療腎小球腎炎的臨床觀察[J].中國處方藥，2016（8）：99-100.

[2] 張新蓮.麻黃連翹赤小豆湯合當歸飲子加減治療慢性蕁麻疹療效觀察[J].實用中醫藥雜志，2017（6）：628-629.

[3] 王敏，李樹君.麻黃連翹赤小豆湯治療蕁麻疹臨床體會[J].實用中醫藥雜志，2016（11）：1136-1137.