基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的益母草治療心梗潛在靶點的研究

楊雨微 聶銳 單鑫 陳靜 汪潔 呂志陽

摘 要：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究益母草治療心梗的作用機(jī)制。采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及技術(shù)平臺（TCMSP）根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18的條件篩選出益母草中的化學(xué)成分及相關(guān)作用靶點，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫找出官方基因名稱。利用疾病靶點相關(guān)數(shù)據(jù)庫檢索與心梗相關(guān)的靶點基因。將活性成分所對應(yīng)的靶點基因和心梗相關(guān)的靶點基因交集，獲得兩者的共同基因即為益母草治療心梗的關(guān)鍵靶點。使用Cytoscape軟件構(gòu)建中藥-活性成分-關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)度值進(jìn)行篩選，尋找益母草治療心梗的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。將關(guān)鍵靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫獲得蛋白互作關(guān)系，結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行可視化。利用DAVID數(shù)據(jù)庫及ClueGo插件對關(guān)鍵作用靶點進(jìn)行GO注釋分析和KEGG通路分析，探究益母草治療心梗的生物過程及作用通路。

關(guān)鍵詞：益母草；心梗；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；潛在靶點

基金項目：國家自然科學(xué)基金（81073111，81374029，81874359）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK20161371）；江蘇省高校自然基金（18KJB36011）；江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項目（18KJB310012）；2019江蘇省中醫(yī)藥管理局項目（YB201997）

目前，心梗是導(dǎo)致人類死亡的重要原因之一，對于急性心肌梗死來說，主要治療手段是再灌注，減輕再灌注損傷逐漸成為抗心肌梗死的關(guān)鍵問題之一[1]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，中藥在心梗的防治方面有著較好的效果。

益母草[Leonurus artemisia （Laur.） S. Y. Hu F]，為唇形科植物的新鮮或干燥地上部分，味苦、辛，性微寒，歸肝、心包、膀胱經(jīng)，主要功效為清熱解毒、利尿消腫、活血調(diào)經(jīng)。益母草中主要活性成分是鹽酸益母草堿和鹽酸水蘇堿，都能夠增強心血管活性[2]。近30年來，大量的實驗和臨床研究已經(jīng)證明益母草堿具有溶栓、子宮興奮、降脂、抗凝、抑制血小板的聚集、降低血液黏度、減少紅細(xì)胞聚集、改善微循環(huán)、改變氧自由基等作用，從而為其用于心梗的治療提供了依據(jù)[3]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過構(gòu)建藥物化學(xué)成分、作用靶點與疾病靶點之間的關(guān)系，從多成分、多靶點的角度闡明其作用機(jī)制。擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選出益母草的化學(xué)成分和作用靶點，同時檢索疾病相關(guān)靶點，利用用于注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫（the Database for Annotation， Visualization and Integrated Discovery，DAVID）及ClueGo分析探究益母草治療心梗的潛在作用通路，為臨床治療心梗提供新思路。

1 材料與方法

1.1 益母草活性成分的篩選

采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及技術(shù)平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）篩選益母草中的活性成分。FJHQT作為湯劑，基于類藥性（Drug-Like，DL）≥0.18和口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%篩選，收集益母草的活性成分，同時利用TCMSP和文獻(xiàn)檢索收集其作用靶點。

1.2 構(gòu)建活性成分-作用靶點

將益母草的作用靶點名稱標(biāo)準(zhǔn)化，同時刪除重復(fù)項得到潛在作用靶點。利用Cytoscape軟件構(gòu)建“活性成分-潛在作用靶點”網(wǎng)絡(luò)互作圖。

1.3 心梗靶點的收集

在GeneCards數(shù)據(jù)庫和人類在線孟德爾遺傳平臺（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）上，以“Myocardial infarction”為關(guān)鍵詞，搜索與心梗相關(guān)的疾病作用靶點并刪除重復(fù)項進(jìn)行整合。

1.4 關(guān)鍵作用靶點的確定

將藥物作用靶點與疾病靶點交集，從而確認(rèn)益母草治療心梗的關(guān)鍵作用靶點，為后續(xù)進(jìn)一步構(gòu)建蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖提供依據(jù)。

1.5 關(guān)鍵作用靶點構(gòu)建“蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)”相互作用網(wǎng)絡(luò)

String數(shù)據(jù)庫可用于構(gòu)建“蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)”相互作用關(guān)系，將益母草治療心梗的關(guān)鍵作用靶點數(shù)據(jù)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，選擇“Multiple Proteins by Names”/“Identifiers”一欄，將Organism設(shè)置為“Homo sapiens”，點擊“search”，將“minimum required interaction score”一欄數(shù)值設(shè)置為大于0.9，點擊update，獲得蛋白互作關(guān)系，將得到的結(jié)果以TSV格式導(dǎo)出。

1.6 關(guān)鍵作用靶點的GO富集及KEGG通路分析

通過DAVID數(shù)據(jù)庫對關(guān)鍵作用靶點進(jìn)行GO富集分析，分析選擇細(xì)胞的組成（Cell Composition，CC）、分子的功能（Molecular Function，MF）和生物的過程（Biological Process，BP）3個因素，得到GO富集結(jié)果。利用 Cytoscape中的ClueGo插件對關(guān)鍵靶點進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析，從而得到益母草治療心梗的作用信號通路。

2 結(jié)果

2.1 益母草活性成分及相關(guān)靶點信息

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢到益母草的化學(xué)成分52個。通過OB和DL值進(jìn)行篩選得到其活性成分9個，將其相關(guān)靶點蛋白名記錄于Excel表格中。

2.2 益母草潛在作用靶點預(yù)測結(jié)果及“活性成分-潛在作用靶點”網(wǎng)絡(luò)分析

通過TMCSP數(shù)據(jù)庫收集52個活性成分的潛在作用靶點，將潛在作用靶點的蛋白名導(dǎo)入，得到對應(yīng)的官方基因名。將活性成分及331個潛在作用靶點導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行可視化，構(gòu)建“活性成分-潛在作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，從而揭示化學(xué)成分與靶點之間的關(guān)系（見圖1）。

2.3 關(guān)鍵作用靶點的蛋白互作關(guān)系

將上述156個關(guān)鍵作用靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建“蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)”PPI網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置研究物種為人類，在“minimum required interaction score”一欄，將其數(shù)值設(shè)置為大于0.9，點擊“start”，得到蛋白互作關(guān)系。

2.4 關(guān)鍵作用靶點的生物功能預(yù)測及作用通路分析

通過Cytoscape軟件中的ClueGo插件對關(guān)鍵靶點進(jìn)行KEGG通路富集分析，其中P<0.05的通路被顯著富集。通過DAVID數(shù)據(jù)庫對上述關(guān)鍵作用靶點進(jìn)行GO注釋分析。

3 討論

心肌梗死是一種非常嚴(yán)重的致命性疾病，其總死亡率可達(dá)30%。中藥益母草治療心梗的作用機(jī)制尚不明確，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究益母草治療心梗的潛在作用機(jī)制，避免單靶點的局限，從探索研究多靶點出發(fā)，能夠更加明確益母草治療心梗的主要物質(zhì)基礎(chǔ)及其潛在的作用機(jī)制，為中藥治療心梗提供更多科學(xué)依據(jù)。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法對益母草進(jìn)行研究，得到益母草9個入血活性成分，預(yù)測了331個潛在作用靶點。在GO富集分析結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)預(yù)測的關(guān)鍵靶點主要通過調(diào)控血管生成、血管發(fā)育、血栓形成等環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。在KEGG通路分析結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)預(yù)測的關(guān)鍵靶點主要集中作用在TNF通路、AGEs-RAGE通路和TGF等信號通路。這些通路主要在炎癥、纖維化和免疫等方面發(fā)揮作用。

4 結(jié)語

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測益母草防治心梗的關(guān)鍵靶點及其信號通路，推測該藥對疾病的潛在作用機(jī)制，可能主要參與抗炎、調(diào)節(jié)免疫及纖維化等過程，為闡明中藥治療心梗的作用機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] WANG W D，WANG W，CHENG L，et al.Protection effects of Yindan xinnaotong and main components on myocardial ischemia reperfusion injury[J].China Journal of Chinese Materia Medica，2014（9）：1690.

[2] CHEN J M.A survey of motherwort research[J].Journal of Shenyang Pharmaceutical University，1991（4）：296-298.

[3] CHEN S R，ZhENG H R，CHEN H Q，et al.Study on the treatment of myocardial ischemia by the motherwort preparation[J].Chinese Critical Care Medicine，2002（1）：19-22.