間接免疫熒光法和實時熒光定量PCR對小兒肺炎支原體感染臨床診斷價值的研究

文/吳婷娜（內江市第一人民醫院）

肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae,MP）是呼吸道感染常見病原體[1]，支原體肺炎即原發性非典型肺炎，多發于學齡前兒童，經由呼吸道飛沫傳播，其臨床癥狀和體征不具有特異性，僅憑臨床表現或影像學檢查等難以與一般病毒或細菌感染相鑒別，容易漏診而錯失最佳治療時機，因此，盡早診斷肺炎支原體感染至關重要。臨床實驗室肺炎支原體感染的檢測方法包括血清學檢測、微生物快速培養、分子生物學檢測等，本研究回顧性分析63 例于我院診斷的小兒肺炎支原體感染患者的情況，所有患者均使用間接免疫熒光法檢測肺炎支原體特異性IgM 抗體及實時熒光定量PCR 檢測肺炎支原體DNA，通過分析檢測結果，探討兩種檢測方法對小兒肺炎支原體感染診斷的臨床應用價值，現報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

對2019 年9 月-2020 年9 月收治入我院的63 例肺炎支原體感染患兒進行回顧性分析，所有患兒均符合《諸福棠實用兒科學》中支原體肺炎診斷標準。所有患兒均使用間接免疫熒光法檢測血清肺炎支原體特異性IgM 抗體及實時熒光定量PCR 檢測咽拭子/痰液肺炎支原體DNA。63 例患兒中，男性33 例，女性30 例；年齡1-11 歲，平均年齡（4.86±3.14）歲；病程2-30d，平均病程（9.52±8.58）d，病程<7d 者39 例，病程≥7d 者24 例。

1.2 儀器與試劑

Smart32 全自動核酸提取儀（中山大學達安基因股份有限公司）、DA7600 實時熒光定量PCR 儀（中山大學達安基因股份有限公司）、EUROStar Ⅲ Plus 熒光顯微鏡（德國歐蒙醫學實驗診斷有限公司）、肺炎支原體核酸檢測試劑盒（PCR 熒光探針法）（中山大學達安基因股份有限公司）、呼吸道病原體譜抗體IgM 檢測試劑盒（間接免疫熒光法）（德國歐蒙醫學實驗診斷有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 標本采集

（1）血清：采集患兒的空腹靜脈全血標本約2ml并及時分離出血清，2-8℃保存，24h 內完成。

（2）咽拭子：用咽拭子取咽部分泌物，將咽拭子植入無菌玻璃管，密封送檢。

（3）痰液：使用一次性吸痰器，患兒取仰頭平臥位，將吸痰管緩緩插入咽喉部，調節負壓，將氣管深部分泌物（在霧化吸入后效果較好）緩緩吸入儲液瓶中，反復數次，儲液瓶中分泌物即為標本，密封送檢。

1.3.2 肺炎支原體特異性IgM 抗體檢測

應用間接免疫熒光法檢測肺炎支原體特異性IgM 抗體，熒光顯微鏡下觀察到特異性的熒光模型判定為陽性。整個過程嚴格按照肺炎支原體特異性IgM 抗體檢測標準操作規程和試劑盒使用說明書進行操作。

1.3.3 肺炎支原體DNA 檢測

應用核酸提取試劑在核酸提取儀上對肺炎支原體的DNA 進行提取，隨后使用PCR 試劑在PCR 擴增儀上進行擴增，擴增結束后對結果進行解讀，增長曲線呈S 型曲線且Ct 值<40 判定為陽性。整個過程嚴格按照肺炎支原體核酸檢測標準操作規程和試劑盒使用說明書進行操作。

1.3.4 觀察指標

比較兩種方法的肺炎支原體陽性檢出率；分析兩種方法在不同病程的陽性檢出率情況。不同病程分別為病程<7d和病程≥7d。

1.4 統計學處理

采用SPSS19.0 軟件進行統計學分析。計數資料以例數或百分率表示；A 組和B組陽性檢出率的差異性用四格表資料的卡方檢驗進行分析，P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種檢測方法對肺炎支原體感染檢測結果的比較

見表1。63 例患者中，實時熒光定量PCR 檢出陽性48 例（76.19%），間接免疫熒光法檢出陽性18 例（28.57%），前者陽性檢出率高于后者，P<0.05，差異具有統計學意義。

2.2 不同病程肺炎支原體檢出情況的比較

見表2。對于病程<7d 的患兒，實時熒光定量PCR 的陽性檢出率為92.31%，明顯高于間接免疫熒光法（7.69%），差異具有統計學意義。而對于病程≥7d 的患者，兩種檢測方法陽性檢出率無顯著性差異。

表1 兩種檢測方法診斷肺炎支原體結果比較[n(%)]

表2 不同病程診斷肺炎支原體結果比較[n（%）]

3 討論

肺炎支原體是兒科常見的感染性病原體，有報道稱肺炎支原體肺炎患兒可占住院肺炎患兒的40%[2]。小兒感染肺炎支原體后，由于其臨床表現缺乏特異性，因此鑒別診斷并不容易，常常出現誤診或漏診的情況[3]。該疾病病程可持續較長時間，且可發生較多肺外并發癥[4]，但肺炎支原體對大環內酯類抗菌藥物敏感[5]，因此，如果在感染初期得到有效診斷，對患兒的治療則具有重大意義。本研究回顧性分析間接免疫熒光法與實時熒光定量PCR 對肺炎支原體感染的診斷價值，表1 表明實時熒光定量PCR 對肺炎支原體感染的陽性檢出率明顯高于間接免疫熒光法，一方面可能是由于PCR 方法的靈敏度及特異度較高，另一方面，48 例實時熒光定量PCR 檢出陽性而抗體陰性的患者中，有9 例病程已接近1個月，Nilsson 等[6]報道，肺炎支原體急性感染患者喉部殘留的DNA 片段可以存在較長時間，可持續45-52d，此時仍可從患者口咽部檢測到殘留的核酸片段，但特異性IgM 抗體可能已消退至無法檢出。此外，抗體產生亦與年齡、病程、免疫功能等相關，如對于年齡較小的患者，其免疫系統發育尚不完全，可導致血清學檢驗產生假陰性現象[7]。表2 表明，兩種檢測方法陽性檢出率與病程相關，對于病程<7d 的患者，DNA 檢出陽性率高于特異性IgM 抗體，通常，IgM 抗體于感染1 周后出現，一般可持續3-4 周，因此，對于病程<7d 的患者，考慮其特異性IgM 抗體還未產生或其濃度低于檢出限，而實時熒光定量PCR 由于其高靈敏度，可在病程早期檢出肺炎支原體DNA。

4 結論

綜上所述，對于小兒肺炎支原體感染患者，實時熒光定量PCR 可直接檢測病原體核酸，本研究顯示其陽性檢出率高于血清學檢測，特別是對于病程早期患者，分子生物學方法可及早檢出病原體，有效縮短診斷周期，具有較高的臨床應用價值。