復方黃芪白術藥對的發酵研究

高　越

復方黃芪白術藥對的發酵研究

高越

（衡水學院河北衡水053000）

復方黃芪白術是常用的中藥藥對，黃芪、白術均為補氣類中藥，都能起到免疫調節作用，在畜牧業應用廣泛。用枯草芽孢桿菌發酵黃芪白術藥對，采用蒽酮-硫酸法測量發酵前后的多糖含量，以多糖含量為指標設計正交試驗。試驗結果表明，發酵時間4 d、接菌量4％、含水量50％、發酵溫度32 ℃是最佳發酵條件，該條件下發酵復方黃芪白術的多糖含量為18.32％，與發酵前相比提高了44.59％。

黃芪白術藥對；中藥發酵；枯草芽孢桿菌；多糖

中草藥作為飼料添加劑在畜牧業中具有廣泛的應用前景，與抗生素類添加劑相比具有毒副作用小、無耐藥性、無殘留、經濟環保等優勢，在動物保健、提高畜禽生產性能、改善畜禽產品質量和提升飼草料品質等方面具有重要作用[1]。傳統中藥炮制方法效率較低，利用微生物發酵中草藥，更容易破壞植物細胞壁使細胞破裂，釋放其中的活性物質。中藥發酵技術能夠增加中草藥有效成分的利用率，提高藥效，降低藥物毒副作用，修飾中草藥活性成分[2]。

中藥黃芪、白術為常用的補氣藥，二者配對應用，具有較高的研究價值。黃芪、白術具有增強動物免疫力和恢復受免疫抑制動物免疫力的效用，張槐以雛雞為試驗動物，考察試驗藥物對新城疫疫苗抗體水平的影響，黃芪與白術比例為1:1時，雛雞ND抗體水平最高，具有較好的免疫增強作用[3]。本試驗用枯草芽孢桿菌對復方黃芪白術進行發酵，研究發酵后主要活性成分多糖的含量變化情況，為中藥發酵技術在畜牧養殖業中的應用提供理論依據。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

黃芪、白術、枯草芽孢桿菌由衡水學院發酵工程實驗室提供，葡萄糖、乙醇、LB培養基、蒽酮、濃硫酸、鹽酸等試劑購于衡水瑞豐化玻儀器有限公司。

1.2 儀器

紫外可見分光光度計、中藥粉碎機、烘箱、電子天平、水浴鍋、恒溫搖床、雙人凈化工作臺等儀器由衡水學院食品學實驗室提供。

2 試驗方法

2.1 中草藥預處理

黃芪、白術烘干后粉碎過篩，按照黃芪：白術=1：1的比例配比，混合均勻后在超凈工作臺中紫外滅菌。

2.2 培養基的配制

LB液體培養基：蛋白胨10 gL、酵母提取物5 gL、氯化鈉10 gL、去離子水，在121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌20 min。

2.3 枯草芽孢桿菌種子液的制備

將冷凍保存的枯草芽孢桿菌接種于LB液體培養基，在37 ℃條件下恒溫培養48 h，得到枯草芽孢桿菌種子液。

2.4 接種發酵

在種子液中加入適量無菌水充分混合均勻，取出準備好的黃芪白術中藥基質，邊攪拌邊加入菌液中。接種完成后于恒溫培養箱中在一定溫度下發酵若干天。

2.5 單因素試驗

本試驗選取發酵時間、接菌量、含水量、發酵溫度4 個因素，分析各因素對黃芪白術藥對中多糖含量的影響。

2.6 正交試驗

在單因素試驗基礎上，選取發酵時間、接菌量、含水量、發酵溫度為試驗因素，分別取3 個水平，以發酵后黃芪白術藥對的多糖含量為指標，設計L9(34)正交試驗。

2.7 多糖含量的測定

繪制葡萄糖標準曲線：配制1 mg/mL葡萄糖標準溶液，分別準確吸取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4 mL該溶液于具塞試管中，分別加蒸餾水使體積為2 mL，加入8 mL新配制的蒽酮-濃硫酸溶液，震蕩混合均勻后，各試管同時沸水浴加熱10 min，冷卻至室溫后，在625 nm處檢測其吸光度。根據測量結果以葡萄糖的含量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。得到回歸方程：=8.301 8 x+0.014 9，相關系數2=0.999 6。

水提醇沉法提取樣品中的粗多糖，配制成多糖溶液，準確吸取2 mL多糖溶液于具塞試管中，按制作葡萄糖標準曲線的操作測定625 nm處的吸光度，計算樣品多糖含量。

3 結果分析

3.1 單因素試驗結果

3.1.1 不同發酵時間對多糖含量的影響

發酵時間分別3 d、4 d、5 d、6 d、7 d時，發酵黃芪白術藥對的多糖含量分別為16.21%、17.50%、16.94%、16.03%、15.57%。發酵時間3 d時多糖含量達到最高，之后隨時間降低，試驗得到最佳發酵時間為3 d。

3.1.2 不同接菌量對多糖含量的影響

接菌量分別2%、4%、6%、8%、10%時，多糖含量分別為15.23%、17.78%、17.11%、16.64%、16.04%。接菌量為4%時多糖含量最高，之后隨接菌量的增加而降低，試驗得到最佳接菌量為4%。

3.1.3 不同含水量對多糖含量的影響

含水量分別30%、40%、50%、60%、70%時，多糖含量分別為16.83%、17.10%、17.66%、16.83%、15.82%。含水量為50%時多糖含量最高，之后隨含水量的增加而降低，最佳含水量為50%。

3.1.4 不同發酵溫度對多糖含量的影響

發酵溫度分別28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃時，多糖含量分別為14.87%、15.92%、17.45%、17.02%、16.08%。發酵溫度為32 ℃時多糖含量最高，之后隨發酵溫度的升高而降低，最佳發酵溫度為32 ℃。

3.2 正交試驗結果

以多糖含量為指標，通過正交試驗優化枯草芽孢桿菌發酵黃芪白術藥對的工藝。正交試驗的測定結果見表1，顯著性分析見表2。

表1　正交試驗對多糖含量測定結果的影響分析

表2　正交實驗對多糖含量測定結果影響的顯著性分析

分析表1、表2可知，發酵時間、接菌量、含水量對多糖含量均有顯著性影響，各因素對多糖含量影響的強弱順序為：發酵時間＞接菌量＞含水量＞發酵溫度。確定各因素的最優組合為A3B2C2D2，即優化的發酵工藝為：發酵時間4 d、接菌量4％、含水量50％、發酵溫度32 ℃。

3.3 驗證試驗

以最優發酵工藝組合A3B2C2D2進行三組驗證試驗，三次結果取平均值，測得發酵后復方黃芪白術藥對的多糖含量為18.32％，與正交試驗的最高值17.56％相比提高了4.33%。與未經發酵的復方黃芪白術多糖含量12.67％相比提高了44.59％。

4 討論

通過正交試驗確定了枯草芽孢桿菌發酵復方黃芪白術的最佳條件為：發酵時間4 d、接菌量4％、含水量50％、發酵溫度32 ℃。在該條件下發酵復方黃芪白術，測得多糖含量為18.32％，與發酵前相比提高了44.59％。結果表明，通過微生物發酵技術可以有效提高復方黃芪白術藥對的多糖含量。發酵中草藥應用在畜牧業中，具有無殘留、低毒性、經濟環保等優勢。黃芪多糖和白術多糖具有增強動物機體免疫力、提高動物生長性能、調節機體代謝的作用，在動物生產中應用廣泛[4-5]。應用微生物發酵技術發酵復方黃芪白術藥劑，可以有效提高其主要活性成分多糖的含量，從而達到提高藥效及利用率的效果。

[1]池永寬,劉旭光,熊康寧,等.中草藥飼料添加劑應用研究進展[J].中國野生植物資源,2020(9):57-63.

[2]艾素,湯偉,郭若琳,等.微生物發酵中草藥及其活性物質的研究進展[J].中國中藥雜志,2019(6):1110-1118.

[3]張槐.復方芪術顆粒的研制及其免疫增強作用研究[D].揚州:揚州大學,2019.

[4]史洪濤.黃芪-枯草芽孢桿菌發酵制劑的制備及其在肉雞上的應用研究[D].鄭州:河南農業大學,2014.

[5]胡曉蕾,胡迎利,汪以真.白術及白術多糖對SD大鼠生長性能和免疫功能的影響[J].中國獸醫雜志,2016(1):2-6.

衡水市科技計劃項目，復方黃芪白術藥對微生物發酵研究（NO：2019014029Z）

10.3969/j.issn.2095-1205.2020.12.11

R289.1

A

2095-1205(2020)12-22-02