乳酸菌降膽固醇作用及降解機制研究進展

劉孝芳，雷文平，2，遲珺曦，劉成國，2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學 食品科技學院，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學 食品科學與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128）

膽固醇是一種人體必需的甾類化合物，其含量在血液中超出正常值時，人體則患高膽固醇血癥。19～20世紀，研究人員就針對膽固醇含量與人體健康的關(guān)系進行了大量研究，1847年，VOGEL醫(yī)生發(fā)現(xiàn)動脈血管粥樣硬化斑塊中存在膽固醇；1913年，NIKOLAI ANITSCHOV發(fā)現(xiàn)血液中過剩的膽固醇造成嚴重的動脈硬化癥[1]。過剩的膽固醇含量會引起腦血栓、冠心病等心腦血管疾病，這類疾病一般靠他汀類藥物或手術(shù)治療，但手術(shù)治療風險大、價格高，他汀類藥物服用后對人體機能有損傷，副作用大、價格高。因此，如何降低治療的風險和價格是亟待解決的問題。從患者膳食著手，食用乳酸菌制品是治療高膽固醇血癥患者的有效方法[2]，大多數(shù)乳酸菌制品具有降膽固醇特性，且安全性高、價格低，可逐步替代藥物治療。

乳酸菌是一類無芽孢、革蘭氏染色呈陽性的細菌，它通過乳酸發(fā)酵產(chǎn)生有機酸、特殊酶系等物質(zhì)。以上物質(zhì)賦予乳酸菌諸多生理功能[3]：維持腸道平衡、增強免疫功能、延緩人體衰老、改善人體機能等。目前已證實乳酸菌對降低膽固醇產(chǎn)生顯著作用[4]，主要通過共沉淀作用、吸收吸附及蛋白質(zhì)調(diào)控作用實現(xiàn)。本文就國內(nèi)外學者關(guān)于乳酸菌降膽固醇的體外、體內(nèi)研究及機制進行總結(jié)，并對研究現(xiàn)狀進行分析與展望，為后續(xù)深入乳酸菌降膽固醇作用研究奠定基礎(chǔ)。

1 乳酸菌降膽固醇特性

1.1 乳酸菌體外降膽固醇的效果

乳酸菌體外降膽固醇的效果一般是通過溶鈣圈法、甲基紅-溴酚藍顯色劑法[5]篩選出乳酸菌，再將菌株培養(yǎng)于含適量膽固醇培養(yǎng)基中，測定菌株對培養(yǎng)基中膽固醇的去除率。體外研究結(jié)果能夠證明乳酸菌具有降膽固醇的潛力，該結(jié)果是進一步研究的基礎(chǔ)。范穎等[6]對來源于西藏地區(qū)的乳酸菌進行研究，利用鄰苯二甲醛方法測定膽固醇去除率，發(fā)現(xiàn)20株乳酸菌膽固醇去除率＞20%，其中植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）膽固醇去除率最高，可達47.89%。任大勇等[7]從東北傳統(tǒng)食品篩選出57株植物乳桿菌膽固醇去除率＞40%，其中6株去除率＞85%。吳海珍等[8]從酸奶、泡菜和青貯飼料中分離得到90株乳酸菌中，初篩得到18株膽固醇去除率＞35%的乳酸菌，其中植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）JY20和JY41效果最好，將其與山楂混合發(fā)酵后，與降脂有關(guān)的活性成分含量及膽固醇和膽鹽吸附能力顯著提高。研究表明，不同地區(qū)、不同種的乳酸菌，在體外降膽固醇的效果大多數(shù)呈良好狀態(tài)。

1.2 乳酸菌體內(nèi)降膽固醇的效果

在體外降解能力的基礎(chǔ)上，菌株還必須耐受人體內(nèi)嚴苛的消化環(huán)境，才能發(fā)揮降解體內(nèi)膽固醇的作用。自1974年以來，MANG G V等[9]研究發(fā)現(xiàn)，東非的馬賽人血清中的血脂含量普遍偏低，是由于馬賽人長期食用含嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）的發(fā)酵乳制品，從而猜測這種菌株具有降低人類血清中膽固醇含量的功能。PARK Y H等[10]研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）43121能夠降低對高膽固醇血癥誘導的豬血清膽固醇含量。HEO W等[11]利用泡菜中分離的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）LRCC 5273喂食LP 5273組小鼠（以高膽固醇食物為食），又利用等量的生理鹽水喂食對照組小鼠（以商業(yè)正常食物為食），6周后測量小鼠的血脂含量，通過對比對照組和LP 5273組小鼠的膽固醇含量發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）LRCC 5273具有體內(nèi)降膽固醇的作用。SAVARD P等[12]也曾通過58名健康志愿者連續(xù)食用4周加拿大Yoptimal酸奶（雙歧桿菌（Bifidobacterium）BB12和嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）LA-5在每份酸奶中的含量為109CFU）的試驗，發(fā)現(xiàn)Yoptimal酸奶中的活菌可降低志愿者血清膽固醇含量并維持在正常范圍內(nèi)。

體外呈現(xiàn)良好降膽固醇效果的菌株，在體內(nèi)不一定呈現(xiàn)。LIN S Y等[13]研究發(fā)現(xiàn)，服用了嗜酸乳桿菌（具備體外降膽固醇能力）的354名志愿者血液中的膽固醇含量并無顯著變化，由此說明具備體外降解能力的菌株，還要根據(jù)其對人體消化環(huán)境的耐受性及在胃腸道的定植情況，判斷是否可降低人體內(nèi)膽固醇含量。

2 乳酸菌降膽固醇作用機制

關(guān)于乳酸菌降膽固醇作用機制的假說，主要有以下幾類：①乳酸菌可分泌膽鹽水解酶，該酶將結(jié)合態(tài)膽鹽水解成游離的膽汁酸，在酸性環(huán)境下，游離的膽汁酸與膽固醇共同沉淀，以沉淀的形式排出體外；②乳酸菌的細胞膜通過吸附固定或直接吸收將膽固醇截留；③乳酸菌對膽固醇合成與分解中的關(guān)鍵酶、前體物質(zhì)等起調(diào)控作用，調(diào)控膽固醇在人體內(nèi)的代謝，進而減少膽固醇在血液中的含量；④乳酸菌代謝產(chǎn)物能與游離的膽汁酸結(jié)合，游離的膽汁酸被結(jié)合后能抑制腸肝循環(huán)的進行，以減少膽固醇的吸收。

2.1 乳酸菌自身酶的水解產(chǎn)物與膽固醇發(fā)生共沉淀

血液中膽固醇的來源主要有兩種，一種是通過外源性食物獲取的，另一種則是通過內(nèi)源性代謝自身合成的[14]。膽汁酸的生物合成與內(nèi)源性膽固醇的主要代謝去路有關(guān)，同時膽汁酸作為膽汁的重要組成成分具有乳化等作用，又與膽固醇的排泄有關(guān)，由此可見膽汁酸的代謝過程對人體內(nèi)膽固醇的排泄起著重要作用。

膽汁酸按照結(jié)構(gòu)分為兩類，一是游離型膽汁酸；二是結(jié)合型膽汁酸，由游離型膽汁酸與甘氨酸或牛磺酸所結(jié)合而成，結(jié)合型比游離型膽汁酸更穩(wěn)定，在酸和Ca2+存在的情況下不易沉淀析出[15]。膽汁酸還可按來源分為兩類，一是初級膽汁酸，由膽固醇直接合成；二是次級膽汁酸，是初級膽汁酸在腸道中，由7α-羥化酶催化，經(jīng)脫羥基作用形成的。ISHIMWE N等[16]研究報道，初級膽汁酸是由食品中的膽固醇形成的，初級膽汁酸又與甘氨酸或牛磺酸通過酰胺鍵結(jié)合成甘氨膽酸或牛磺膽酸最終形成結(jié)合型膽汁鹽。結(jié)合型膽汁鹽的溶解性較好，易被人體吸收進入腸肝循環(huán)，導致膽固醇再血液中的積累。大量研究表明，乳酸菌能合成膽鹽水解酶，此酶作用導致酰胺鍵斷裂，將結(jié)合型膽汁鹽水解成游離的初級膽汁酸，而游離的初級膽汁酸溶解性差，不易被腸道吸收，以糞便的方式排出體外，最終使人體內(nèi)膽固醇含量降低或維持平衡。

“共沉淀”現(xiàn)象[17]是大多學者較認可的降解機制，即乳酸菌發(fā)酵液pH值＜6.0時，體系中游離的膽汁酸開始沉淀，但此時的膽固醇未沉淀；一旦將pH值調(diào)節(jié)到＜5.5時，體系中的膽固醇會隨著游離的膽汁酸一起沉淀。“共沉淀”現(xiàn)象受到體系中pH值和膽固醇膠束穩(wěn)定狀態(tài)的共同影響[18]，游離的膽汁酸的酸度系數(shù)（pKa）較低，一般為5.0～6.0，當環(huán)境中的pH值＜5.0時，游離膽汁酸的溶解性變得極差，由TAHRI K 等[19]的體外試驗證明，體系中的pH值為4.0～5.5時，游離的膽汁酸和膽固醇共沉淀，當利用緩沖劑將pH值回升到7.0時，沉淀發(fā)生了可逆性的溶解，以上可見“共沉淀”在4.0＜pH＜5.5的范圍內(nèi)發(fā)生。另外，在培養(yǎng)基中，當膽固醇以膠束狀態(tài)存在時，結(jié)合型膽汁鹽有利于維持它的穩(wěn)定存在，但在酸性環(huán)境下，游離的膽汁酸可以打破膽固醇膠束穩(wěn)定的狀態(tài)，從而發(fā)生共沉淀；若膽固醇以非膠束狀態(tài)存在，即便體系中的pH值降至4.0，這種非膠束狀態(tài)的水溶性膽固醇也不會隨游離的膽汁酸沉淀而共沉淀[20]，由此說明“共沉淀”現(xiàn)象的發(fā)生與膽固醇存在的形式及膠束狀態(tài)下的穩(wěn)定性密切相關(guān)，只有當體系環(huán)境pH值處于4.0～5.5，且膽固醇以膠束狀態(tài)存在時，這一降解機制才成立。BRASHEARSM M等[21]利用干酪乳桿菌探索菌株去除膽固醇機制的實驗也證實了此觀點。

2.2 乳酸菌對膽固醇的吸收與吸附作用

乳酸菌不僅能利用自身酶的作用，使體系降低對膽固醇的吸收，還能通過自身組織結(jié)構(gòu)截留膽固醇。乳酸菌能直接吸收膽固醇至細胞內(nèi)，也能將膽固醇吸附在菌體的細胞膜表面，從而達到去除膽固醇的目的。目前已有研究報道乳酸菌對膽固醇的吸收吸附作用，NOH D O等[22]研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌ATCC 43121具備吸收膽固醇的能力。李雅迪[23]通過實驗得到植物乳桿菌S11菌株在含有膽固醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，菌株針對培養(yǎng)基中的膽固醇去除率高達79.17%，同時檢測到實驗組以下組分中膽固醇的含量：①培養(yǎng)上清液中約為0.021 mg/mL②菌體破碎后洗脫上清液中約為0.036 mg/mL③菌體細胞碎片懸浮液中約為0.002 mg/mL。實驗組菌體破碎后洗脫上清液的膽固醇含量比對照組的高0.033 mg/mL，說明該植物乳桿菌S11能直接吸收膽固醇以降低膽固醇含量。LIONG M T等[24]研究也表明，所有的乳酸菌菌株能夠吸收膽固醇，其吸收的范圍在12.03～32.25 μg/mL。

細胞膜是菌體固有的結(jié)構(gòu)，只要結(jié)構(gòu)存在，膽固醇就能被吸附，KIMOTO H等[25]報道活菌體和熱殺死菌體都可以脫除培養(yǎng)基中的膽固醇，但熱殺死菌體的膽固醇去除率遠不及活菌體。以此可見，細胞膜本能地對膽固醇進行吸附。趙瑞香等[26]利用電鏡掃描觀察嗜酸乳桿菌菌體吸附膽固醇的現(xiàn)象，在不含膽固醇培養(yǎng)基中的菌體表面平滑、無附著痕跡，形狀為細桿狀，而在含膽固醇培養(yǎng)基中的菌體表面粗糙、附著痕跡明顯，形狀為粗短桿狀或橢圓狀。呈被吸附狀態(tài)的膽固醇比較穩(wěn)定，一般的洗滌方式不能破壞這種穩(wěn)定，但可通過離心方式破壞。此外，菌體吸附膽固醇后可能改變了細胞膜的組成結(jié)構(gòu)，細胞膜的韌度也隨著結(jié)構(gòu)的變化而增強[27]，不含膽固醇培養(yǎng)基中的菌體和含膽固醇培養(yǎng)基中的菌體同時進行超聲波處理，結(jié)果表明后者對超聲波的抵抗能力更強，云月英等[28-29]均證實吸附膽固醇的菌株對超聲波的抗性強。以上試驗均證明菌體能夠通過細胞膜吸收、吸附的方式降低膽固醇（吸附作用對降解膽固醇的作用影響甚微），但這些實驗現(xiàn)象均出自于體外探究，僅能視為乳酸菌體外降解膽固醇的方式。

2.3 乳酸菌控制膽固醇代謝的相關(guān)蛋白質(zhì)

膽固醇在人體內(nèi)的吸收、合成、分解均與蛋白質(zhì)的表達有關(guān)。3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase，HMG-CoA-R）、膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7 alpha hydroxylase，CYP7A1）控制著體內(nèi)膽固醇的合成；尼曼-匹克C1型類似蛋白1（niemann-pick type C1 like 1，NPC1L1）參與著膽固醇的吸收過程；CYP7A1、膽鹽水解酶（bile salt hydrolase，BSH）能促進膽固醇的分解與排泄。

甲羥戊酸（mevalonic acid，MVA）是合成膽固醇的前體物質(zhì)，它是由3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）經(jīng)HMG-CoA-R催化生成的，因此HMG-CoA-R作為膽固醇合成中的限速酶，乳酸菌通過抑制其活性便可降低膽固醇的合成量。膽酸同樣作為合成膽固醇的前體物質(zhì)，其合成過程中的限速酶是CYP7A1，乳酸菌可提高CYP7A1的活性，控制膽酸的合成速率從而抑制體內(nèi)膽固醇的合成[30]。WANG C Y等[31]發(fā)現(xiàn)，用乳酸菌發(fā)酵的谷物糊狀物喂養(yǎng)高脂倉鼠，能使高脂倉鼠CYP7A1的活性增強，最終將體內(nèi)富余的膽固醇以糞便的形式排出體外。LI C等[32]發(fā)現(xiàn)，高脂大鼠口服植物乳桿菌NCU116后，CYP7A1的表達得以改善，高脂大鼠通過體內(nèi)對CYP7A1的調(diào)控來控制自身脂質(zhì)代謝，以保持正常膽固醇含量。小腸內(nèi)膽固醇的吸收與NPC1L1表達密切相關(guān)，NPC1L1是膽固醇吸收過程中的轉(zhuǎn)運體。田建軍等[33]報道乳酸菌可以抑制NPC1L1的表達，再進一步地抑制膽固醇的吸收，此文還提到CYP7A1在膽固醇分解中起作用，它也是膽固醇分解代謝過程中的限速酶，提高它的活性不僅可以抑制膽固醇的合成還能加強膽固醇的分解排泄。BSH在“共沉淀”現(xiàn)象中也起著關(guān)鍵性作用，由BSH催化形成的游離態(tài)膽酸在酸性條件下與膽固醇共同沉淀排出體外，董改香等[34]經(jīng)研究表明，乳酸菌BSH活性高低影響小鼠血液膽固醇含量。以上提到的蛋白質(zhì)、前體物質(zhì)，類似“控制閥”，乳酸菌能對它們進行控制，以便促進或抑制膽固醇在體內(nèi)的合成、分解。膽固醇血癥、心腦血管疾病的治療，一般采用含以上蛋白質(zhì)的藥物來緩解病癥，同樣地，乳酸菌也具備這樣的潛力。

2.4 乳酸菌的代謝產(chǎn)物與膽固醇黏附

乳酸菌的代謝產(chǎn)物種類繁多，胞外多糖就是其中一類。胞外多糖是乳酸菌在生長代謝途中分泌至細胞壁外的一類碳水化合物。突破以往的機制研究發(fā)現(xiàn)，這種由乳酸菌產(chǎn)生的分泌物—胞外多糖，也具備降低血液中膽固醇含量的能力，BHAT B等[35]研究發(fā)現(xiàn)，從人乳中分離得到的產(chǎn)胞外多糖副干酪乳桿菌M7有良好的降低膽固醇功能特性，體外試驗顯示產(chǎn)胞外多糖的副干酪乳桿菌M7能呈現(xiàn)較高的膽固醇降低活性（70.78%）。PIGEON R M等[36]通過研究報道，利用產(chǎn)胞外多糖菌體發(fā)酵的發(fā)酵乳喂養(yǎng)小鼠，可以降低小鼠的血清膽固醇含量，而不產(chǎn)胞外多糖菌體發(fā)酵的發(fā)酵乳未能達到此效果。具有降低膽固醇的效果還要歸結(jié)于產(chǎn)胞外多糖的菌體可以黏附游離的膽汁酸，切斷結(jié)合型膽汁酸的合成，進而降低膽固醇的合成量。隨即猜測胞外多糖可能對膽固醇的結(jié)合、吸收、排泄等代謝過程起到了重要的作用。“胞外多糖和游離膽汁酸的黏附”與共沉淀機制中“與游離的膽汁酸結(jié)合”頗為相似，前者是胞外多糖與游離的膽汁酸結(jié)合，結(jié)合后導致膽汁酸無法被腸道吸收，抑制了腸肝循環(huán)的進行，而后者是膽固醇與游離的膽汁酸結(jié)合，二者在酸性條件下形成沉淀排出體外。

3 結(jié)論與展望

人體血液中的膽固醇含量超出正常范圍值，隨著血液的黏稠度提高，人體的心臟負荷增加。另外黏稠物還可以在血管壁上堆積，出現(xiàn)血管粥樣硬化斑塊的現(xiàn)象，是心腦血管疾病的前兆。關(guān)于乳酸菌各種降膽固醇假說機制，其中游離的膽汁酸去路是值得更深入研究的。起初報道游離的膽汁酸通過直接結(jié)合膽固醇的方式降低了膽固醇的溶解性，以沉淀的方式排出體外，再是游離的膽汁酸與胞外多糖的結(jié)合，從而抑制腸肝循環(huán)和腸道對膽固醇的吸收，那么在膽固醇代謝過程中，游離的膽汁酸產(chǎn)生與排泄途徑值得人們更深入的了解和探討。除此之外，實驗篩選出的菌株，其降解膽固醇能力又受自身種類、生長狀況及培養(yǎng)條件等影響，不僅同一菌屬的菌體降解能力差異大，而且同一株菌在同一批次的實驗中表現(xiàn)出的降解能力仍有一定的差異。在未來的研究中，怎樣縮小同一菌株降解能力的差異性也顯得尤為重要。

如果要將降膽固醇乳酸菌制品應(yīng)用到生產(chǎn)加工中，首先要保證安全性。因為在膽鹽水解酶將結(jié)合型膽汁鹽水解成游離的膽汁酸時，會伴有脫氧膽酸和石膽酸的產(chǎn)物，而這兩種膽汁酸對人體有致癌作用。此外，還可從來源上抑制人類對高膽固醇食物的攝取，進而控制人體內(nèi)膽固醇的含量，如讓牲畜食用降解膽固醇的菌株，家雞食用后，雞蛋內(nèi)膽固醇含量明顯降低，食用這種低膽固醇含量的雞蛋將不會增加人體患高膽固醇血癥的風險。微生物降低人類患病概率具有相當多的優(yōu)勢，乳酸菌作為微生物的一種，用來降低膽固醇含量有著廣闊的發(fā)展前景。