包裝紙中異噻唑啉酮的檢測技術研究

朱翔 汪宣 王蕾 徐文君 項佳凝 徐瑩 陳麗娜

摘要：建立了一種超高效液相色譜法測定（UHPLC）包裝紙原紙和包裝紙中2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮（MI）、5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮（CMI）和1，2-苯并異噻啉-3-酮（BIT）含量的快速分析方法。樣品經水溶液超聲提取、離心、有機濾膜過濾后，進行液相分析，EclipsePlus C18 RRHD色譜柱分離，流動相選擇甲酸水-甲醇溶液，采用梯度洗脫方式。此外，還對提取溶劑、提取時間、紫外檢測波長進行了研究。在最優檢測條件下，三種異噻唑啉酮在0.02～5.0 mg L-1范圍內均呈良好的線性關系（R2均大于0.999），包裝紙原紙中，低、中、高濃度加標回收率在80.7～99.4%之間，相對標準偏差不高于3%，MI、CMI、BIT的檢出限分別為0.0204、0.0310、0.0397 mg kg-1，定量限分別為0.0680、0.103、0.132 mg kg-1。包裝紙中，低、中、高濃度加標回收率在80.9～112.4%之間，相對標準偏差不高于6%，MI、CMI、BIT的檢出限分別為0.0286、0.0189、0.0264 mg kg-1，定量限分別為0.0954、0.0631、0.0880 mg kg-1。該方法已應用于實際樣品的檢測，有望為包裝紙的綠色、安全印刷提供保障。

關鍵詞：異噻唑啉酮；檢測技術；超高效液相色譜法；包裝紙；綠色印刷

中圖分類號：TB484 文獻標識碼：A 文章編號：1400 （2020） 06-0059-05

A Rapid Determination of Isothiazolinone In Packaging Paper

ZHU Xiang， WANG Xuan， WANG Lei， XU Wen-jun， XIANG Jia-ning， XU Ying， CHEN Li-na（Shanghai Tobacco Packaging And Printing Co.， LTD.， Shanghai 200137， China）

Abstract： A rapid ultra-high performance liquid chromatography （UHPLC） method was developed for the quantitative anaylsis of three isothiazolinone biocides （2-methyl-4-isothiazolin-3-one （MI）， 5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one （CMI） and 1，2-benzylisothiazolin-3-one （BIT） in original paper samples and packaging paper. Before UHPLC analysis， the sample was extracted with water， and purified by ultrasonic extraction， centrifugation， and filtration. The sample was separated using a EclipsePlus C18 RRHD column. The mobile phases was formic acid water-methanol under gradient elution. Besides， factors such as extraction solvents， extraction time， and UV detection wavelength were also studied. Under the optimized condition， the method exhibited a linear relationship in the concentration range of 0.02～5.0 mg L-1 （R2>0.999）. In original paper samples， the spike recovery for low， medium and high concentration was in the range of 80.7～99.4% with the relative standard deviations less than 3%. The limits of detection （LOD） were 0.0204、0.0310、0.0397 mg kg-1 and limits of quantification （LOQ） were 0.0680、0.103、0.132 mg kg-1. In packaging samples， the spike recovery was in the range of 80.9～112.4% with the relative standard deviations less than 6%. The limits of detection （LOD） were 0.0286、0.0189、0.0264 mg kg-1 and limits of quantification （LOQ） were 0.0954、0.0631、0.0880 mg kg-1. The method with high accuracy has also been applied to the determination of isothiazolones in real samples. It is a potential technical for green and safe printing of packaging paper.

Keywords： isothiazolones， rapid determination， ultra-high performance liquid chromatography method， packaging paper， green and safe printing

引言

異噻唑啉酮類物質由于抗菌能力強、應用劑量小、溶解性好、低毒性、低殘留、易降解等優點，已被廣泛用于水處理、鋼鐵冶煉、油田注水、煉油廠、火力發電廠、大型化肥廠、造紙廠、輕紡、水涂涂料、工業清洗等領域[1]。其中，制漿造紙工業中為防止紙張生產過程中漿料腐敗、變質，常使用2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮（MIT）、5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮（CMI）和1，2-苯并異噻唑啉-3-酮（BIT）作為防腐劑。盡管異噻唑啉酮類物質毒性較低，但它與皮膚接觸可能引起過敏或皮炎等反應，過量接觸還可導致皮膚灼傷[2]。國內外對食品接觸材料、玩具、化妝品等日用品中相關異噻唑啉酮類殺菌劑的使用均有嚴格的限制，我國食品容器和包裝材料標準對MIT、CMI和BIT的限量要求分別為0.5 mg/kg、不能檢出（N.D.=0.01 mg/kg）和1.2 mg/kg [3]，煙草行業也將三類有機殺菌劑列為關注物質，對其有明確的最大使用量要求。[4]

目前，異噻唑啉酮類殺菌劑的檢測方法主要包括分光光度法[5]、液相色譜-紫外法（HPLC-UV）[6]、液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）[7]和氣相色譜質譜法（GC-MS）[8]。分光光度法中涉及到使用還原劑、顯色劑，步驟較繁瑣、容易引入二次污染；異噻唑啉酮類物質極性較大、沸點較高，需衍生化后才能進行GC/MS分析，衍生化過程耗時長且需進一步凈化，增加了檢驗時間，而且會導致回收率降低；LC-MS/ MS方法雖然有較好的回收率、較低的檢出限、較高的靈敏度，但是三重四極桿液質聯用儀儀器昂貴、參數設置較為復雜，對檢測者的實驗能力提出很高的要求，因此檢測成本較高；同時，碰撞電壓以及離子源等的優化需要較長的時間，造成檢測的時間偏長。相比較而言，HPLC-UV方法儀器較為簡單、操作較為便捷，進行簡單的前處理后即可上樣分析。然而，高效液相色譜法的局限性也很明顯，煙用紙張種類較多，其生產和印刷工藝較復雜，且異噻唑啉酮類殺菌劑含量較低，它帶來的問題是在檢測較低濃度樣品時可能出現假陰性的現象或者受到樣品中其他物質的干擾。如何提高檢測靈敏度是有機殺菌劑檢測中的關鍵所在。超高效液相色譜的出現可以解決目前的問題。超高效液相色譜法的原理與高效液相色譜法基本相同，但有更多的優點：（1）UHPLC能夠使用更小顆粒的高性能微粒固定相。固定相的顆粒越小、微孔孔徑越大、傳質阻力就越小，傳質速率就越高，這樣的孔徑更加利于物質分離。（2）超高壓輸液泵的使用可以充分發揮色譜柱的作用，快速分離樣品。（3）UHPLC采用高速采樣、靈敏度更高的檢測器，提高分析物質的能力。（4）UHPLC進樣系統使用低擴散、低交叉污染自動進樣器。配備了針內進樣探頭和壓力輔助進樣技術，使進樣更為精確、降低污染的可能性?？傊?，與傳統的HPLC法相比，UHPLC的分析速度、靈敏度及分離度分別是HPLC的9倍、3倍及1.7倍，僅縮短了分析時間，同時減少了溶劑用量降低了分析成本。[9]

目前國內雖然有煙用水基膠中異噻唑啉酮類殺菌劑部分研究報道[10-11]，但卷煙包裝紙中有機殺菌劑的研究以及相關標準較少，為此，開發高靈敏、高效的有機殺菌劑檢測技術具有較為實際的意義。

1 實驗部分

1.1儀器與試劑

儀器：Agilent 1290 Infinity II超高效液相色譜儀（美國Agilent公司，配有二極管陣列檢測器）；電子天平（感量：0.1 mg，瑞士Mettler Toledo公司）；移液器（德國brand公司）；5804R高速離心機（德國eppendorf公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）；2700TH超聲波清洗器（上海安普實驗科技股份有限公司）；cary 100紫外光譜儀（美國Agilent公司）。

試劑：MI、CMI和BIT（純度≥98%，德國Dr公司）；色譜純乙腈、甲醇、甲酸、0.22 μm有機相濾膜、一次性注射器（上海安普實驗科技股份有限公司）；各種規格、容量瓶和具塞錐形瓶（德國witeg公司）：符合GB/T6682規定的一級水。

1.2色譜條件

分析柱：EclipsePlus C18 RRHD（50×3.0 mm，1.8μm）；柱溫：30℃；進樣量：10 μL；流速0.5 mL/min；DAD檢測波長：0～2.5 min：275 nm，2.5～7.0 min：318 nm；流動相A為0.1%甲酸-水，B為甲醇；梯度洗脫條件：0～2.5 min，A相為75%，B相為25%；2.5～5.0 min，A相為75%，B相為25%；5.0～7.0 min，A相為75%，B相為25%。由保留時間定性，外標法定量。

1.3標準溶液的配制

分別準確稱取5 mg MI、CMI和BIT于50 mL容量瓶，用水定容配制成濃度為100 mg L-1的標準儲備溶液；分別取20、50、100、200、1000、3000、5000 μL的混合標準溶液，用水溶液定容至100 mL容量瓶中，得到0.02、0.05、0.1、0.2、1.0、3.0、5.0 mg L-1系列標準溶液。

1.4樣品前處理

稱取2.0 g試樣，精確至0.1 mg，置于50 mL具塞三角瓶中，準確加入20 mL水，蓋緊瓶塞，在超聲儀上以100 W功率超聲30 min，取上層清液過0.22μm有機相濾膜，濾液置于進樣瓶中待液相色譜分析。

2 結果與討論

2.1色譜條件選擇

2.1.1檢測波長的確定

分別取三種標準溶液與比色皿中，在230～500 nm范圍進行紫外光譜掃描，如圖1所示，結果表明MI、CMI和BIT的最大吸收波長分別為275 nm、275 nm和318 nm，因此選擇275 nm和318 nm作為檢測波長。

2.1.2流動相的選擇

實驗考查了甲酸水溶液-乙腈、甲酸水溶液-甲醇為流動相的兩個體系對分離分析的影響。甲酸水溶液-乙腈體系雖然分析時間更短，但考慮實際樣品檢測時基質對測試會有一定影響，三個緊挨著的峰可能會被基質干擾，因此采用甲酸-水溶液進行洗脫。

2.1.3流動相比例的優化

考察了三個梯度洗脫條件對色譜峰分離的影響。當采取梯度洗脫1條件進行實驗時，三個色譜峰得到有效分離，并且峰形較尖，然而峰與峰之間時間間隔較長，有進一步優化的空間。因此采用2中條件進行實驗，其保留時間均縮短，然而第三個色譜峰的峰形欠佳。針對第三個峰的分離采用條件3進行優化，當甲酸水-甲醇的體積比為75：25時，BIT和MI兩種異噻唑啉酮的分析時間較短、峰形較好，保留時間分別為0.64和1.59 min。當甲酸水-甲醇的體積比為50：50時，CMI分分離情況較好，保留時間為2.59 min?？紤]到實際樣品檢測時，基質會引入較多的雜峰，易產生干擾，三種物質的保留時間不宜過近，才有利于利用外標法進行分析。因此，最終確定的流動相比例為條件3，標樣及樣品的色譜圖如圖2所示。

2.2 樣品前處理方法優化

2.2.1提取溶劑的選擇

文獻報道了三種異噻唑啉酮易溶于甲醇、丙酮、乙腈和乙酸乙酯等有機溶劑，也易溶于水。實驗針對不同極性的提取劑進行考察。結果發現，乙腈提取效果差；甲醇對BIT這種物質的回收率較差，僅為50%左右，而水作為提取劑的回收率均在80%以上，因此本研究最終選用了水作提取劑。一方面可以降低使用有機溶劑，實驗過程較為綠色環保；另一方面可以避免甲醇溶劑效應的影響，文獻報道純甲醇提取液直接進樣時，MI有明顯的溶劑效應，因此，上機前采用超純水稀釋來降低溶劑效應，但這會導致實驗步驟繁瑣、靈敏度降低。[12]

2.2.2 提取時間的選擇

比較了超聲提取時間為20，30，40，50 min時樣品中三種目標物的峰面積情況，實驗結果見表2，可見超聲提取時間對目標物含量測定的影響不明顯，但考慮到實際樣品中目標物提取的充分性，因此選擇振蕩時間為30 min。

2.2.3 工作曲線、檢出限和定量限

在最優條件下，對濃度為0.02～5.0 mg L-1的標準工作溶液進行測定，以目標物峰強度（Y）對標準工作溶液的濃度（X）進行標準曲線繪制，MI、CMI和BIT在0.25～5.0 mg L-1范圍內呈良好的線性關系，相關系數都為R2=0.9999。將最低濃度的標準溶液平行測定6次，所得測定結果標準偏差的3倍為方法檢出限（LOD），10倍為方法定量限（LOQ），包裝紙原紙中 MI、CMI、BIT的檢出限分別為0.0204、0.0310、0.0397 mg kg-1，定量限分別為0.0680、0.103、0.132 mg kg-1；包裝紙樣品中，MI、CMI、BIT的檢出限分別為0.0286、0.0189、0.0264 mg kg-1，定量限分別為0.0954、0.0631、0.0880 mg kg-1。

2.2.4 精密度和準確度

精密度是以相對標準偏差的形式表示。平行試驗的精密度可用以驗證方法的重復性。選取三個加標濃度分別進行6次平行實驗，所得結果見表3、表4，在三個加標水平上，結果的相對標準偏差均小于5%，結果表明方法的精密度良好。

準確度一般通過回收率的結果體現，實驗測試了三個加標水平上的6個平行實驗的加標回收率的平均值，所得結果見表3、表4。包裝紙原紙中，低、中、高濃度加標回收率在80.7～99.4%之間，相對標準偏差不高于3%。包裝紙樣品中，低、中、高濃度加標回收率在80.9～112.4%之間，相對標準偏差不高于6%。結果表明，該分析方法對異噻唑啉酮的測定結果具有準確性。

2.2.5 實際樣品的分析

應用所建立的方法測定包裝紙、包裝紙原紙中異噻唑啉酮的殘留量，結果如表所示，表明包裝紙中異噻唑啉酮的使用量差異顯著，對其使用量進行標準化管理具有很強實際意義。

3 結論

本工作利用超高效液相色譜法建立了一種包裝紙和包裝紙原紙中甲基異噻唑啉酮的快速、高效的檢測方法。該方法前處理條件綠色環保，避免使用大量的有機溶劑；檢測時間較短，是一種快速的定性定量方法；線性范圍較寬，不僅滿足低濃度樣品檢測，也可以可靠測量高濃度樣品。不足之處在于液相方法靠保留時間定性，容易受到基質干擾，因此，進一步工作將聚焦前處理方法的優化，以減少基質效應帶來的問題。

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