發酵米粉中微生物及對米粉品質影響研究進展

熊香元 張立釗 陳力力 周 玥

(湖南農業大學食品科技學院；食品科學與生物技術湖南省重點實驗室1，長沙 410128)

米粉是以大米為原料，經浸泡(發酵)、清洗、磨漿、蒸擠等步驟制成的條狀或片狀產品，在我國及東南亞具有廣闊市場[1]。根據大米浸泡時間長短可分為發酵和非發酵米粉,米粉生產常用發酵法，即將大米浸泡3～7 d后制成比非發酵制品質構特性和食用品質更佳的米粉，如柔韌筋道,口感滑潤，不易渾湯等[2]。發酵后米粉的直鏈淀粉含量上升，灰分、蛋白質和脂肪含量減少，這可能是發酵過程中微生物產生的酸、酶促進脂肪和蛋白質分解，淀粉得到純化[3]。

目前大多數發酵米粉工廠采用傳統的自然發酵法進行生產，米粉發酵過程中受到生產環境、操作者和原料等因素影響，微生物菌群較為豐富，發酵時間隨季節性變化較大，導致發酵米粉產品質量不穩定。因此，為提高米粉的工業化水平和安全性，了解自然發酵米粉中微生物種群及其對發酵米粉品質的影響十分重要。本文綜述了國內外微生物發酵米粉研究的最新進展，旨在為相關研究提供參考。

1 發酵米粉中的微生物

1.1 米粉發酵中的乳酸菌

米粉發酵過程中微生物種群復雜，其中起主要作用的是一類能發酵糖類，產物為乳酸的無芽孢、革蘭氏陽性乳酸菌。乳酸菌包含許多種屬，不同地區發酵米粉中乳酸菌種屬存在一定差異。Lu等[4]從湖南3家米粉廠分離得到170株乳酸菌，經API 50CHL系統鑒定，分屬于乳桿菌屬(Lactobacullus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、片球菌屬(Pediococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)和氣球菌屬(Aerococcus)。乳桿菌屬細菌種類多，代謝能力強，耐酸性能好，其中的植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、發酵乳桿菌等在食品生產中應用廣泛。史國英等[5]從廣西傳統發酵米粉中分離鑒定出6株乳酸菌，除植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)外，戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)為優勢菌。戊糖片球菌具有提高營養物質合成代謝、提高人體免疫力等益生功能，近年來在發酵肉制品、發酵乳制品和發酵蔬菜類食品加工中的應用已受到了人們的高度重視。另有學者研究了不同發酵時期米粉發酵液中菌相變化，結果表明發酵48 h時，乳酸菌數量急劇上升高達7 lgcfu/mL，主要為德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)、唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)、瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)、發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)、淀粉乳桿菌(Lactobacillusamylovorusand)、口腔乳桿菌(Lactobacillusoris)[6]。筆者利用高通量測序(Illumina Miseq宏基因組測序)技術分析了米粉發酵中細菌多樣性，發現在各個發酵階段乳酸菌相對豐度均在90%以上，采用MRS培養基培養并進行乳酸菌菌落計數，結果表明在整個發酵過程中乳酸菌數量一直上升，最高可達2.56×108CFU/mL，且泰國發酵米粉中優勢菌群也是乳酸菌[7]。乳酸菌具有消化淀粉、糖、蛋白質或脂肪的能力，對大米淀粉改性和純化，改善米粉質地起著重要的作用，然而，目前研究主要集中在發酵米粉中乳酸菌的數量和菌群變化方面，對改善發酵米粉品質的優良菌株篩選及相關生物學特性等報道較少。

1.2 米粉發酵中的酵母菌

米粉浸泡發酵過程中除乳酸菌占絕對優勢外，還存在一定數量的酵母菌，酵母菌在食品加工中應用廣泛，且具有一定的積極作用[8]。大米浸泡發酵中的酵母菌主要是熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，這類酵母不但參與醛縮醇類、含硫化合物等香味物質的生成，而且還一定程度地參與氨基酸和有機酸類的生成，因此能顯著增加米粉的香氣成分[9,10]。另外，乳酸菌與酵母菌存在協同作用，即酵母菌產生維生素和氨基酸等供乳酸菌生長所需，同時乳酸菌代謝產生有機酸為酵母菌增殖創造酸性環境[11]。

1.3 米粉發酵中的霉菌

米粉浸泡發酵過程中產生霉菌的報道較少，可能因為米粉浸泡發酵是在靜置、密封發酵罐中進行的液態發酵，環境中氧氣含量較少，不適于大多數霉菌生長。但是成品米粉由于貯藏不當而造成的霉菌污染需要引起重視[12,13]，石文松等[14]對某市預包裝濕米粉微生物污染狀況進行調查發現，33批檢測樣品中均有微生物污染，且優勢菌群之一為霉菌。

1.4 米粉發酵中的其他細菌

筆者利用高通量測序技術分析了米粉發酵過程中細菌多樣性，發現除占絕對優勢的乳酸菌外，樣品中還存在醋酸桿菌、腸球菌等。米粉在發酵和成品貯藏階段存在腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌污染的風險[15,16]。羅素梅[17]等2016年采集蘆淞區150份即食米粉樣品進行食源性致病菌調查分析，結果大腸菌群、蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌檢出率分別為17.3%、13.3%、 0.7%，污染菌的來源與多種因素有關。米粉發酵生產中，如何控制危害米粉品質的污染菌，提高發酵米粉的安全水平，有待進一步研究。

2 發酵米粉中微生物的作用

2.1 對物理性質的影響

對比發酵前后米粉質構特性發現，發酵后米粉硬度提高了4.07%～19.31%、黏聚性提高了13.79%～18.97%、同時，膠著度、咀嚼性、回復性和拉伸力也分別提高了24.83%～34.41%、28.89%～31.27%、66.67%～126.67%和10.25%～100.00%；發酵改善了米粉的質地、延展性、抗斷能力和凝膠網絡強度，成品米粉更加筋道富有彈性[18,19]。這一系列物理性質的改變與微生物在發酵中產生的代謝產物，如酸和酶等使大米中直鏈淀粉含量變化有關[20],但是目前有關微生物對發酵米粉物理性質變化的研究不夠深入，未來可以利用現代分析技術從微觀結構層面進一步深入研究微生物引起發酵米粉物性變化的機理。

2.2 對化學性質的影響

研究表明秈米發酵1 d后蛋白質、脂肪含量分別降低了1.24%、0.4%；直鏈淀粉增加了2%[21]。另有報道大米發酵36 h后，除蛋白、脂肪含量下降外，發酵液pH從初始6.50迅速降至3.35，脂肪酸值、還原糖和白度均有不同程度升高[22]。Masayo[23]對柬埔寨發酵米粉進行分析，發現發酵后大米蛋白質分子質量從14.3 KDa下降到3.5 KDa，總氨基酸、乳酸含量分別增加了80.5 mg/100 g、1.58 g/100 g。由此說明發酵過程中微生物的作用導致大米主要化學成分及含量發生變化。在此基礎上人們研究了發酵對大米中活性成分的影響，發現經過稻谷的去芽、去殼、去胚等步驟處理后的精米中γ-氨基丁酸的含量甚微，而在30 ℃水中浸泡發酵3 d后，γ-氨基丁酸含量高達25.63 mg/100 g，進一步研究證明，發酵微生物能分泌的谷氨酸脫羧酶 (Glutamate decarboxylase, GAD)催化大米谷氨酸脫羧反應生成γ-氨基丁酸[24]。發酵過程中大米化學成分的變化對成品米粉品質形成十分重要，然而目前對于微生物菌群代謝與大米理化變化之間的關聯規律研究鮮見報道。

2.3 對感官品質的影響

由于發酵改變了大米質構特性，使得發酵米粉的硬度、咀嚼性增加，黏性、吐漿率和斷條率降低；蛋白質和脂肪降解，使包埋在其中的礦質元素釋放溶解，米粉白度增加且具有較透明的外觀；并且米粉產生濃郁的米香，其口感、韌性和透明度等感官評價指標明顯優于未發酵米粉[25-27]。Jeesuda等[28]使用氣質聯用法分析發酵米粉khanom jeen，發現擁有43種揮發性成分，如2-甲基丙酸、3-甲基丁酸、二乙酰、乙酸乙酯等增加了米粉特殊的風味物質。發酵引起的感官品質變化，能賦予產品更好的食味。

2.4 對微觀結構的影響

發酵后由于蛋白質的變化，原來處于結合狀態的淀粉被釋放出來，糊化時溶脹性增加, 膨脹力和熱糊黏度顯著降低，并更易于形成氫鍵締合，從而改善米粉組織結構[29]。發酵前后米粉微觀結構發生改變，未發酵米粉由表達蛋白body-蛋白簇狀結構組成，而發酵后的淀粉凝膠結構中僅含均勻球形的表達蛋白body-蛋白體；在掃描電鏡下觀察到發酵后淀粉的結晶度和特征黏度較發酵前降低[30,31]。米粉微觀結構變化與發酵中微生物菌群間的相關性值得深入研究。

2.5 對安全性的影響

發酵米粉口感爽滑，有韌勁，其品質優于非發酵米粉，深受消費者歡迎，但自然發酵過程中微生物大量繁殖而導致產品質量不穩定、甚至食源性致病菌污染的安全性問題值得關注。發酵米粉中主要的微生物指標是菌落總數、大腸桿菌和芽孢桿菌等[32,33]，從大米發酵到成品米粉各個階段存在金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等微生物污染的潛在危害[34,35]。目前，人們進行了利用乳酸菌發酵產生細菌素、抑菌肽等抑制有害菌的生長和構建預測模型控制發酵時間，提高米粉安全性的研究[36]。

3 微生物純種強化發酵對米粉品質的影響

米粉純種強化發酵是在米粉自然發酵的基質中接入優良的純種微生物所進行的混合發酵，此方法有助于改善自然發酵過程中微生物種群難以控制，發酵周期不確定，產品質量不穩定、安全性得不到充分保障的現狀，適應發酵米粉的大規模工廠化生產。目前，人們在純種強化發酵菌種篩選、發酵方式及其對米粉品質影響等方面開展了研究。

3.1 對理化性質的影響

從自然發酵米粉中分離不同種類乳酸菌、酵母菌等優勢菌，采用單一菌種強化發酵和混合多菌種混合強化發酵方面，李蕓等[37]按照1∶1∶1∶1的比例接種植物乳桿菌、發酵乳桿菌、熱帶假絲酵母、枯草芽孢桿菌進行多菌種混合強化發酵，發現相較自然發酵，強化發酵后大米的蛋白質、淀粉質量分數分別降低了14.05%、11.39%，直鏈淀粉提高3.88%；而且，強化發酵后大米表面形成許多類似海綿的多孔結構。Li等[38]以不同比例乳酸菌和假絲酵母接種發酵大米，發現兩者比例為5∶5和8∶2時，可以有效地改變淀粉顆粒的完整性，增加米粉硬度、咀嚼性和口感，同時通過調節米粉的結構和理化特性改善米粉的色澤、香氣，米粉的質量較自然發酵有所提高。周顯青等[39]對比植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和釀酒酵母強化發酵對大米的影響，發現植物乳桿菌發酵米粉的綜合品質最好。然而，大量研究表明利用純種植物乳酸菌發酵米粉均能得到較自然發酵更好的理化性質，但是植物乳桿菌蛋白水解系統不完全，存在肽轉運系統和胞內肽酶，缺乏胞壁蛋白酶，對大米中蛋白質含量減少作用不明顯，因此，混菌發酵是有效的方法，利用蛋白酶活力強的乳酸菌水解大米中蛋白質，釋放多肽，而植物乳桿菌利用這些多肽在胞內進行進一步水解生成氨基酸，滿足生長需求提高米粉品質[40]。

3.2 對香氣成分的影響

大米特殊的米香能賦予米粉更好的食味品質，純種強化發酵能使米粉中香氣成分更豐富。采用胚芽乳桿菌∶釀酒酵母菌(1∶2)復合菌種發酵，能在米粉中檢測到二十九烷、1,3,5,7-環辛四烯、苯乙醇、1,1-二十二烷氧基十六烷、乙酸乙酯等主要香氣成分[41]。植物乳桿菌發酵后，產生的主要揮發性成分由醛類 (乙醛) 、酸類 (乙酸、3,4-二甲基苯甲酸) 、酮類 (2-壬酮) 、烴類 (1-甲基-4-1-甲基亞乙基-環已烯) 、醇類 (苯乙基醇、十一醇) 、酚類 (麝香草酚) 、糖類 (木糖)及其他化合物組成[42-45]。混菌強化發酵中，優勢菌酵母菌能以淀粉為原料合成氨基酸，氨基酸在酶作用下生成酮類和醇類；乳酸菌能通過磷酸戊糖途徑(HMP)生成乙酸，乳酸等；其產生的醇和酸發生酯化反應生成酯類物質，從而促進了米粉香味物質的形成[46,47]。純種強化發酵米粉揮發性成分種類豐富，但是發酵過程中微生物組成與風味的關聯規律還需進一步深入研究。

3.3 對色澤及質構特性的影響

米粉經過微生物發酵后其質構特性發生改變，且純種發酵改變更加顯著。研究報道乳酸乳球菌純種發酵米粉，其硬度、彈性、咀嚼性、回復性相較于自然發酵分別提高了88.32%、7.33%、168.37%、96.63%，純菌種發酵米粉在氣味、滋味以及雜質、口感方面得分高于自然發酵米粉[27]。另有學者利用植物乳桿菌和蛋白水解菌發酵大米，其米粉亮度、白度和質構特性也顯著優于自然發酵米粉[48,49]。研究認為，微生物強化發酵后米粉質構和色澤之所以更優于自然發酵是因為純種乳酸菌發酵產生的酸及淀粉酶使支鏈淀粉分子發生斷鏈和脫支,使其平均聚合度下降,平均鏈長變短,削弱了支鏈淀粉分子的再結晶能力[48]。然而，目前純種發酵對米粉色澤的研究中常采用感官評定的方法，不同參與者的主觀差異較大，在未來的研究中可多采用L*、a*、b*色空間法來進行數量判斷。

3.4 對蒸煮特性的影響

強化發酵后米粉中的蛋白質、脂肪、灰分含量降低，直鏈淀粉含量增加；直鏈淀粉易于聚合，老化形成較強的凝膠網絡結構，能降低蒸煮損失率。雙歧桿菌和戊糖片球菌單一菌種強化發酵后米粉的斷條率、蒸煮損失率和膨脹率較自然發酵米粉顯著降低，米粉質量明顯改善，蒸煮品質更好[50,51]。不同乳酸菌發酵米粉均能對米粉蒸煮品質進行改善，但菌株間生物學特性差異較大，如何利用不同菌株間的優勢協同發酵改善米粉蒸煮品質還需要進一步研究。

4 結論與展望

發酵是微生物在無氧或有氧條件下，通過分解代謝或合成代謝或次生代謝等微生物代謝活動，使有機物質發生化學反應的一個過程[52]。自然發酵米粉中主要微生物種群以乳酸菌為主，酵母菌次之，但還是存在一些致病菌的潛在危險。大米主要化學成分為淀粉, 其次為蛋白質、脂肪等,發酵對米粉食品物性、化學性質、感官品質、蒸煮品質等方面均有一定影響，強化發酵米粉比自然發酵米粉具有更好的感官和蒸煮品質。純種發酵不僅在提高米粉食用品質上起著作用，而且對提高米粉安全性、保證產品質量和穩定生產周期、提高工業產量也有著顯著影響。雖然國內外已有一些利用純種強化發酵米粉的研究，但使用的菌種單一，添加的菌種對米粉作用的機理尚不十分明確，直投式米粉發酵劑應用于實際較少，未來可以深入研究可用于改良米粉品質的菌株，并且利用現代生物技術中較為成熟的細胞融合技術結合多種微生物各有的代謝特性提高純種發酵菌株的性能，從而實現高效直投式米粉發酵劑的研發及應用。