魯卡因調節TRAIL基因抑制宮頸癌細胞增殖和誘導細胞凋亡的機制研究

金翠紅, 劉淑娟, 靜金艷

(1.河北省灤平縣中醫院， 河北 灤平 068250 2.河北省承德市婦幼保健院， 河北 承德 067000)

宮頸癌是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤，發病率及死亡率高，而晚期宮頸癌易發生遠處轉移，侵襲性、淋巴轉移率高，預后較差[1]。在治療過程中抑制腫瘤細胞增殖，促進凋亡是治療腫瘤的關鍵。普魯卡因是一種常見的麻醉藥物，近年來研究發現其還有抗腫瘤作用，如普魯卡因對胃癌細胞具有生長抑制和凋亡誘導作用[2]。普魯卡因還可抑制人類白血病細胞的生長[3]。腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(tumor necrosis factor related apoptosis-inducingand，TRAIL)是腫瘤壞死因子超家族成員，可誘導腫瘤細胞凋亡，臨床上是極具潛能的抗腫瘤藥物[4]。研究發現TRAIL能夠誘導人前列腺癌細胞株PC-3細胞凋亡而不損傷正常細胞[5]。但普魯卡因和TRAIL對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響還尚未清楚，本實驗旨在研究普魯卡因和TRAIL對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響及普魯卡因是否通過TRAIL影響宮頸癌細胞的增殖、凋亡。

1 材料與方法

1.1材料：宮頸癌細胞SiHa購自中國科學院上海細胞庫；胎牛血清、RPMI-1640培養基、胰蛋白酶購自美國Gibico公司；普魯卡因購自福州海王福藥制藥有限公司；Lipofectamine TM 2000購自Sigma公司；Trizol試劑、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；MTT試劑盒、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒、BCA試劑盒、RIPA蛋白裂解液、SDS-PAGE試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；抗體購自上海煊翎生物科技有限公司；載體質粒均由金瑞斯生物科技公司構建。

1.2方 法

1.2.1細胞培養:宮頸癌細胞SiHa用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養，2d換液一次，待細胞融合至80%左右時，加入胰蛋白酶進行消化傳代，選取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2藥物處理與分組:當細胞融合至80%左右時，將細胞傳代接種至96孔板中，并用不同濃度的普魯卡因(0.0 mM/L、0.5 mM/L、1 mM/L、2 mM/L)處理SiHa細胞，實驗分為普魯卡因0.0 mM/L組、普魯卡因0.5 mM/L組、普魯卡因1 mM/L組、普魯卡因2 mM/L組。將pcDNA、pcDNA-TRAIL轉染至SiHa細胞，記為pcDNA組、pcDNA-TRAIL組；將si-NC、si-TRAIL轉染至SiHa細胞后用2mM/L的普魯卡因處理，分別記為普魯卡因2mM/L+si-NC組、普魯卡因2mM/L+si-TRAIL組，轉染均采用Lipofectamine TM 2000轉染試劑盒。

1.2.3MTT檢測細胞增殖:在各組細胞培養至48h時加入20μL(5g/L)的MTT溶液，繼續孵育4h；棄去多余培養基并加入150μL DMSO振蕩反應10min，酶標儀檢測490 nm處吸光度(OD)值。細胞增殖抑制率(%)=1-實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。每組重復3次。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡:用不含EDTA的胰酶消化各組細胞，離心收集細胞，PBS漂洗2次，加結合緩沖液重懸細胞。依據試劑盒說明書，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育。流式細胞儀檢測激發波長488 nm和發射波長530 nm處的熒光強度。實驗重復3次。

1.2.5qRT-PCR檢測TRAIL mRNA的表達水平:收集不同濃度普魯卡因處理組細胞，研磨充分后加入Trizol試劑提取總RNA，微量核酸測定儀檢測RNA純度和濃度。使用TaKaRa反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，按照TaKaRa 熒光定量試劑盒使用說明配制反應體系，以β-actin為內參進行PCR擴增，每個樣品重復3次，循環條件為95℃ 30s，60℃ 30s；72℃ 30s，共40個循環；60 ℃延長5min。相對表達量采用2-△△Ct法計算。

1.2.6Western blot檢測蛋白表達:收集各組細胞，加入RIPA裂解液裂解，4℃，12000 g離心15 min，收集蛋白上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳后轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1h。分別加入一抗(1:1000)，4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗(1:2000)室溫孵育2h，TBST洗滌3次，每次10min，后在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達水平。每個蛋白樣品重復3次。

2 結 果

2.1普魯卡因對宮頸癌SiHa細胞增殖、凋亡的影響:Western Blot檢測結果(圖1A，表1)顯示，與普魯卡因0.0mM/L組相比，普魯卡因0.5mM/L、1mM/L、2mM/L組宮頸癌SiHa細胞中CyclinD1、Bcl-2蛋白的表達水平逐漸顯著降低，P21、Caspase-8、Bax蛋白的表達水平逐漸顯著升高(P<0.05)。MTT法檢測結果(表1)顯示，與普魯卡因0.0mM/L組相比，普魯卡因0.5mM/L、1mM/L、2mM/L組宮頸癌SiHa細胞增殖抑制率逐漸顯著升高，呈濃度依賴型(P<0.05)。流式細胞儀檢測結果(圖1B，表1)顯示，與普魯卡因0.0mM/L組相比，普魯卡因0.5mM/L、1mM/L、2mM/L組宮頸癌SiHa細胞的凋亡率顯著升高，呈濃度依賴型(P<0.05)?？梢?，普魯卡因抑制宮頸癌SiHa細胞增殖、促進凋亡。A:增殖、凋亡相關蛋白表達；B：宮頸癌SiHa細胞的凋亡

表1 普魯卡因對宮頸癌SiHa細胞增殖的影響

圖1 普魯卡因對宮頸癌SiHa細胞增殖、凋亡的影響

圖2 TRAIL蛋白表達

2.2普魯卡因對宮頸癌SiHa細胞中TRAIL表達的影響:qRT-PCR檢測結果(表2)顯示，與普魯卡因0.0mM/L組相比，普魯卡因0.5mM/L、1mM/L、2mM/L組宮頸癌SiHa細胞中TRAILmRNA的表達水平逐漸顯著升高，呈濃度依賴型(P<0.05)。Western Blot檢測結果(圖2，表2)顯示，與普魯卡因 0.0mM/L組相比，普魯卡因 0.5mM/L、1mM/L、2mM/L組宮頸癌SiHa細胞中TRAIL蛋白的表達水平逐漸顯著升高，呈濃度依賴型(P<0.05)?？梢姡蒸斂ㄒ虼龠M宮頸癌SiHa細胞中TRAIL的表達。

表2 普魯卡因對宮頸癌SiHa細胞中TRAIL表達的影響

2.3過表達TRAIL對宮頸癌SiHa細胞增殖的影響:Western Blot檢測結果(圖3，表3)顯示，與pcDNA-NC組相比，pcDNA-TRAIL組宮頸癌SiHa細胞中CyclinD1蛋白的表達水平顯著降低，P21蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)。MTT法檢測結果(表3)顯示，與pcDNA-NC組相比，pcDNA-TRAIL組宮頸癌SiHa細胞增殖抑制率逐漸顯著升高(P<0.05)。可見，過表達TRAIL抑制宮頸癌SiHa細胞增殖。

表3 過表達TRAI對宮頸癌SiHa細胞增殖的影響

表4 過表達TRAIL對宮頸癌SiHa細胞凋亡的影響

圖3 TRAIL和增殖相關蛋白的表達

圖4 TRAIL和凋亡相關蛋白的表達

2.4過表達TRAIL對宮頸癌SiHa細胞凋亡的影響:Western Blot檢測結果(圖4，表4)顯示，與pcDNA-NC組相比，pcDNA-TRAIL組宮頸癌SiHa細胞中Bcl-2蛋白的表達水平顯著降低，Caspase-8、Bax蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)。流式細胞儀檢測結果(表4)顯示，與pcDNA-NC組相比，pcDNA-TRAIL組宮頸癌SiHa細胞的凋亡率顯著升高(P<0.05)?？梢?，過表達TRAIL促進宮頸癌SiHa細胞凋亡。

圖5 抑制TRAIL表達對宮頸癌SiHa細胞增殖、凋亡相關蛋白的影響

2.5抑制TRAIL逆轉普魯卡因抑制細胞增殖、促進細胞凋亡的作用:Western Blot檢測結果(圖5，表5，表6)顯示，與普魯卡因 0.0mM/L組相比，普魯卡因 2mM/L組宮頸癌SiHa細胞中CyclinD1、Bcl-2蛋白的表達水平顯著降低，P21、Caspase-8、Bax蛋白的表達水平顯著升高；與普魯卡因 2mM/L+si-NC組相比，普魯卡因 2mM/L+si-TRAIL組宮頸癌SiHa細胞中CyclinD1、Bcl-2蛋白的表達水平顯著升高，P21、Caspase-8、Bax蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)。MTT法檢測結果(表5)顯示，與普魯卡因 0.0mM/L組相比，普魯卡因 2mM/L組宮頸癌SiHa細胞增殖抑制率顯著升高；與普魯卡因 2mM/L+si-NC組相比，普魯卡因 2mM/L+si-TRAIL組宮頸癌SiHa細胞增殖抑制率顯著降低(P<0.05)。流式細胞儀檢測結果(表6)顯示，與普魯卡因 0.0mM/L組相比，普魯卡因 2mM/L組宮頸癌SiHa細胞的凋亡率顯著升高；與普魯卡因 2mM/L+si-NC組相比，普魯卡因 2mM/L+si-TRAIL組宮頸癌SiHa細胞的凋亡率顯著降低(P<0.05)?？梢?，抑制TRAIL逆轉了普魯卡因抑制細胞增殖、促進細胞凋亡的作用。

表5 抑制TRAIL表達對宮頸癌SiHa細胞增殖的影響

表6 抑制TRAIL表達對宮頸癌SiHa細胞凋亡的影響

3 討 論

宮頸癌嚴重地威脅廣大女性生命健康，尋找多種有效治療方法對治療宮頸癌具有重要意義。研究發現普魯卡因可抑制脂多糖誘導的結腸癌細胞腫瘤侵襲性行為[6]。普魯卡因還可通過調節RhoA使ERK / MAPK / FAK通路失活來抑制結腸癌細胞的增殖和遷移[7]。鹽酸普魯卡因通過去ID4基因甲基化抑制白血病HL-60細胞增殖。本研究結果發現，普魯卡因抑制CyclinD1、Bcl-2的表達，促進P21、Caspase-8、Bax的表達；抑制宮頸癌細胞SiHa的增殖，促進細胞凋亡；且還提高了TRAIL的表達水平。

TRAIL是一種凋亡分子，能與死亡受體特異性結合后選擇性誘導癌細胞凋亡，在癌癥的發生、發展和治療方面扮演著重要的角色，是一種有潛力的抗腫瘤細胞因子[8]。研究發現TRAIL可明顯抑制腫瘤生長，誘導黑色素瘤細胞凋亡[9]。TRAIL-R1的單克隆抗體通過激活caspase-8途徑增強了TRAIL誘導的細胞凋亡[10]。阻止caspase-8激活可抑制TRAIL介導的癌細胞凋亡[11]。本研究發現，過表達TRAIL能促進Caspase-8蛋白的表達，抑制宮頸癌細胞SiHa的增殖，促進細胞凋亡，提示TRAIL通過Caspase-8途徑影響了宮頸癌的凋亡。PI3K/mTOR雙靶點抑制劑PI-103與TRAIL聯合應用可使細胞周期停滯在S期，CyclinD1表達水平降低，抑制喉鱗癌細胞增殖。還有研究發現上調P21和TRAIL可抑制黑素瘤HTB-72細胞的生長。本實驗結果顯示，過表達TRAIL降低了CyclinD1蛋白的表達水平，提高了P21蛋白的表達水平[12]。提示，TRAIL可能通過影響CyclinD1和P21的表達水平影響細胞增殖。且本實驗還發現抑制TRAIL表達逆轉了普魯卡因對宮頸癌細胞SiHa的增殖抑制和凋亡促進作用，提示普魯卡因可能影響TRAIL表達影響宮頸癌的凋亡。

綜上所述，普魯卡因可抑制宮頸癌細胞SiHa的增殖，促進細胞凋亡，其機制可能與調控TRAIL有關。將可為宮頸癌的治療提供新思路和新靶點。