某三級醫院甲型流感患兒肺炎鏈球菌耐藥分布及基因分型研究

諸 君， 孔 燕， 史簫笛， 榮強全， 徐 飛

(1.江蘇省南京市高淳人民醫院， 江蘇 南京 211300 2.江蘇省南京市兒童醫院檢驗科， 江蘇 南京 210000)

甲型流感是一種由病毒感染引起的急性呼吸道疾病，具有致病性高、傳染性強、病毒易變異、死亡率高等特點，資料顯示，甲型流感的發病年齡較小，青少年及兒童發病人數約占全部確診人數的60%[1]。研究表明，甲型流感患者常見死亡原因之一是繼發肺部感染，目前臨床上常見的繼發肺部感染病原體包括肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae，SPN)及流感嗜血桿菌等，其中肺炎鏈球菌在重癥甲型流感患兒中發生率較高，而且與非甲流引得肺部感染比較，其具有更強傳染性，對于抵抗能力較差患兒，將嚴重影響患兒生命健康及生活安全[2]。目前由于抗生素的濫用，肺炎鏈球菌對青霉素、紅霉素及萬古霉素等多種抗生素的耐藥性普遍呈上升趨勢，且不同地區、不同人群肺炎鏈球菌的耐藥性存在不同程度差異[3]，因此，臨床上加強對甲型鏈球菌的耐藥檢測具有十分重要的意義。本研究通過對常用肺炎鏈球菌抗菌藥物的耐藥性及耐藥基因分布進行探討，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2016年1月至2019年1月在南京市高淳人民醫院就診的476例甲型流感患兒為研究對象，其中男247例，女229例，年齡0.2～3歲，平均年齡(1.15±0.62)歲，納入標準：①出現流感樣癥狀(包括發熱、鼻塞、流涕、咳嗽、咽痛、頭痛、肌痛、嘔吐、腹瀉、乏力等)；②甲型流感病毒核酸檢測陽性(咽拭子或鼻拭子陽性)；③年齡≤3歲；④患兒家屬均已簽署知情同意書。排除標準：①非甲流患兒；②合并嚴重心、腦、血管疾病患兒；③合并肝、腎功能異常患兒；④合并造血系統等疾病患兒。本研究經南京市高淳人民醫院倫理委員會審批。

1.2方 法

1.2.1標本采集與鑒定:采集甲型流感患兒住院當日咽拭子或鼻拭子標本，將各個咽拭子或鼻拭子標本常規接種于血平板，將其置于35℃，5% CO2的培養箱中培養12～24h，菌落長出后，挑選血平板上呈灰白色、半透明、直徑0.5～1.5cm、表面光滑、菌落周圍有草綠色溶血環的可疑菌落進行純化，經奧普托欣實驗鑒別后，采用美國Biolog全自動微生物鑒定儀(購自華粵行儀器有限公司)進行菌株鑒定。

1.2.2藥敏試驗:采用瓊脂稀釋法通過全自動細菌鑒定/藥敏系統對肺炎鏈球菌進行藥敏檢測確認，采用以ATCC49619作為SP藥敏試驗標準菌株，每次實驗前均做質控對照，ATCC49619菌株購自上海北諾生物科技有限公司。紅霉素、克林霉素、青霉素、萬古霉素、阿奇霉素、頭孢他啶、美羅培南、四環素、利奈唑胺、莫西沙星均購自中國藥品生物制品鑒定所。

1.2.3基因分型檢測:采用聚合酶鏈式反應進行檢測，Zhao等[4]實驗過程進行檢測，pbp2B、ermB、mefA、tetM基因引物均由上海生物工程股份有限公司進行合成，相關引物序列見表1。

表1 引物序列

表2 肺炎鏈球菌藥敏試驗結果

1.3統計學分析:采用SPSS20.0統計學軟件處理數據，計數資料采用“%”表示，組間差異采用“χ2”檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1藥敏試驗結果:476例甲型流感患兒咽拭子或鼻拭子標本中共分離出肺炎鏈球菌36株(7.56%)，其中對紅霉素耐藥35株(97.22%)，對克林霉素耐藥31株(86.11%)，對青霉素耐藥36株(100.00%)，對萬古霉素耐藥3株(8.33%)，對阿奇霉素耐藥30株(83.33%)，對頭孢他啶耐藥32株(88.89%)，對美羅培南耐藥1株(2.78%)，對四環素耐藥36株(100.00%)，對利奈唑胺耐藥11株(30.56%)，對莫西沙星耐藥36株(47.22%)，見表2。

2.2肺炎鏈球菌耐藥基因分型情況:36株肺炎鏈球菌含pbp2B耐藥基因32株(88.89%)，含ermA耐藥基因17株(47.22%)，含mefB耐藥基因21株(58.33%)，含tetM耐藥基因30株(83.33%)，見表3。

2.3不同耐藥細菌的耐藥基因分型情況:pbp2B、ermA、mefB、tetM基因突變與其耐藥表型的測定均具有較高一致性，其中對β-內酯酰胺類抗生素青霉素、頭孢他啶耐藥的肺炎鏈球菌中pbp2B基因檢測出率分別為88.89%、100.00%，對大環內酯類抗生素紅霉素、阿奇霉素耐藥的肺炎鏈球菌中ermA、mefB兩種基因中的任一種或二者同時存在的耐藥基因檢出率分別為97.14%、93.33%，對四環素耐藥的肺炎鏈球菌中tetM基因檢出率為83.33%，見表4。

表3 肺炎鏈球菌耐藥基因分型情況

表4 不同耐藥細菌的基因分型情況

3 討 論

甲型流感是一種急性傳染性疾病，具有起病急、傳染性強及流行廣泛等特點，可通過呼吸道、消化道和眼結膜等多種途徑進行傳播[5]。臨床表現特征為發熱、鼻塞、流涕、咳嗽、咽痛、頭痛、肌痛、嘔吐、腹瀉、乏力等，部分患者出現肺炎鏈球菌感染，少數患者出現多臟器功能衰竭、急性呼吸窘迫綜合征而死亡，其中肺炎鏈球菌感染是甲型流感患者常見和嚴重的并發癥，嚴重威脅甲型流感患者的生命安全。研究表明，流感流行造成的高病死率與并發細菌感染，尤其是肺炎鏈球菌感染密切相關[6]。因此，進一步加強對甲型流感患者肺炎鏈球菌的檢測，重視二者之間的關系，并及時采取相應的治療措施，對于降低甲型流感的死亡率具有十分重要的意義。

目前肺炎鏈球菌臨床上首選的藥物是β-內酯酰胺類抗生素，如青霉素、頭孢他啶等，但近年來由于抗生素的濫用，肺炎鏈球菌對青霉素、頭孢他啶等藥品的耐藥率日益嚴重[7]，本研究從476例甲型流感患兒咽拭子或鼻拭子標本中共分離出肺炎鏈球菌36株(7.56%)，通過分析肺炎鏈球菌對不同類型抗生素的耐藥情況，以有效控制肺炎鏈球菌感染。方潮等[8]研究表明，肺炎鏈球菌對萬古霉素(100.0%)，利奈唑胺(100.0%)和莫西沙星(100.0%)均敏感；而對紅霉素(1.7%)、克林霉素(3.7%)和四環素(5.0%)敏感率低。本研究結果顯示36株肺炎鏈球菌中對紅霉素耐藥35株(97.22%)，對克林霉素耐藥31株(86.11%)，對青霉素耐藥36株(100.00%)，對萬古霉素耐藥3株(8.33%)，對阿奇霉素耐藥30株(83.33%)，對頭孢他啶耐藥32株(88.89%)，對美羅培南耐藥1株(2.78%)，對四環素耐藥36株(100.00%)，對利奈唑胺耐藥11株(30.56%)，對莫西沙星耐藥36株(47.22%)，與方潮等人對利奈唑胺及莫西沙星耐藥率差別較大，可能是由于樣本來源及地區差異等造成的。本研究與陳巧君等[3]對紅霉素、克林霉素及四環素的研究結果大致相符，陳巧君等研究表明SPN對紅霉素、克林霉素及四環素的耐藥率分別為95.6%、84.5%、87.4%，提示臨床上應慎用大環內酯類及四環素、克林霉素等抗生素，合理使用萬古霉素、美羅培南及頭孢素類抗生素作為替代藥物，因此臨床上應加強對肺炎鏈球菌實施藥敏實驗及耐藥性監測，以指導臨床合理使用抗生素。

肺炎鏈球菌青霉素結合蛋白(PBPS)共有6個亞單位，其分別由pbp1A、pbp2A、pbp1B、pbp2B、pbp2X及pbp3編碼，其中肺炎鏈球菌的耐藥主要與pbp2B基因突變有關，變異的pbp2B與β-內酯酰胺類抗生素(包括青霉素、頭孢他啶等)親和力下降，從而產生耐藥性[9]。本研究結果通過分析肺炎鏈球菌耐藥顯示，36株肺炎鏈球菌中含pbp2B耐藥基因32株(88.89%)，pbp2B基因突變與其耐藥表型的測定具有較高一致性，有突變的菌株對青霉素全部耐藥，提示此時臨床上可考慮選用萬古霉素等進行治療，肺炎鏈球菌erm、mef基因是紅霉素類的耐藥基因，ermA、mefB兩種基因中的任一種單獨表達，或二者同時表達，均能夠引起肺炎鏈球菌對大環內酯類抗生素(紅霉素、阿奇霉素)耐藥。本研究結果顯示含ermA耐藥基因17株(47.22%)，含mefB耐藥基因21株(58.33%)，表明ermA、mefB基因的存在可能提示其對紅霉素類抗生素耐藥。本研究結果顯示含tetM耐藥基因30株(83.33%)，對四環素耐藥的肺炎鏈球菌中tetM基因檢出率為83.33%，提示tetM基因存在可能是引起四環素耐藥的主要原因。

綜上所述，肺炎鏈球菌對青霉素、紅霉素、四環素等抗生素的耐藥性較高，不適用于甲型流感患兒肺炎鏈球菌感染的臨床治療，肺炎鏈球菌的耐藥性與相關耐藥基因(pbp2B、ermA、mefB、tetM)的表達有關，臨床上加強病原學檢測，進而為合理選擇抗菌藥物提供可靠依據，另外本研究樣本例數較少，后期準備擴大樣本容量繼續進行研究。