毛竹莖稈快速生長期PeATG1/PeATG4 基因表達分析

卜柯麗， 傅盧成， 王靈杰， 栗青麗， 王柯楊， 馬元丹,2， 高 巖,2， 張汝民,2

（1. 浙江農林大學 林業與生物技術學院， 浙江 杭州311300； 2. 浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室， 浙江 杭州311300）

自噬（autophagy）是進化上保守的細胞內物質的降解途徑， 在真核生物中廣泛存在。 與其他降解系統相比， 自噬最顯著的特征是能降解細胞中如生物分子、 細胞器甚至入侵的微生物等幾乎所有的物質［1］。自噬在饑餓條件下的營養循環中起著重要作用， 能將營養物質重新分配進行物質循環［2-4］。 LI 等［5］對玉米Zea mays研究發現： 自噬在缺氮環境下調控氮回收利用以增加農作物產量； LI 等［6］在谷子Setaria italica中發現： 自噬相關基因SiATG8 在響應氮饑餓耐受中表達上調； AVIN-WITTENBERG 等［7］發現： 碳饑餓條件下自噬能通過降解蛋白質等生物大分子產生氨基酸作為替代性碳源， 供植物體重新利用； 在碳饑餓條件下， 自噬會影響中樞代謝導致擬南芥Arabidopsis thalianaATG（autophagy-related gene）突變體表型與野生型差異明顯。 BARROS 等［8］發現： 在碳饑餓情況下， 自噬中的代謝物循環和呼吸的替代途徑對維持正常的呼吸功能起作用。 自噬在植物體自身生長和發育中也起著重要的作用［9-10］， 如參與根尖的細胞生長和分化［11-12］、 減數分裂后花藥的發育［13］、 氣管元素的分化［14］、 對硝酸鹽的利用率［9］、 對光合作用產生淀粉粒的降解［15］、 在衰老葉片中葉綠體的降解［16-18］、 植物體衰老過程中能量的利用［19］以及植物夜間生長供能物質的利用［20］等等。 GHIGLIONE 等［21］對小麥Triticum aestivum的研究發現： 自噬對其小花發育過程起到作用； KURUSU 等［13］對水稻Oryza sativa研究發現： 自噬缺陷Osatg7 和Osatg9 突變體在正常生長條件下表現出完全的孢子體雄性不育和有限的花藥開裂。 IZUMI 等［19］對水稻的研究發現： 自噬可在葉片變暗引起能量限制時被激活， 對其具有重要的保護作用； TOYOOKA 等［22］對發芽薇甘菊Mikania micrantha種子子葉的超微結構進行觀察， 認為微自噬機制可能參與儲備淀粉的降解； YOSHIMOTO 等［23］發現：當環境中的營養供應有限時， 植物細胞中的養分調動需要自噬。 WANG 等［15］發現： 細胞自噬能夠在夜間對葉片淀粉的降解起作用。 有實驗室證實， 自噬可以在晚間為植物提供能量［20］。 毛竹莖稈生長發育過程的研究分析主要在解剖結構［24］、 反射光譜［25］、 光合酶［26-27］、 碳水化合物代謝［28-30］、 蛋白質組［31］、 基因組學［32-33］等方面。 對模式植物擬南芥和水稻中的研究表明： 自噬對植物生長起重要作用［7,15,19-20］， 而在毛竹Phyllostachys edulis中關于自噬與其快速生長關系的研究鮮見報道。 本研究探討了毛竹莖稈快速生長過程中PeATG1 和PeATG4 基因的表達變化， 以期為毛竹快速生長內在的自噬調控機制及分子生物學基礎提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

供試毛竹采自浙江省杭州市臨安區（29°56′～30°23′N， 118°51′～119°52′E）現代毛竹純林示范園。 該區屬中亞熱帶季風氣候， 溫暖濕潤， 四季分明， 年平均氣溫15.8 ℃， 具有春多雨， 夏濕熱， 秋氣爽，冬干冷的氣候特點。 全年平均日照時數1 847.3 h， 年平均降水量1 628.6 mm, 無霜期234.0 d， 森林覆蓋率76.5%。 毛竹林土壤屬山地紅壤， 土層深度60 cm 以上。

1.2 試驗材料

試驗材料為2018 年當年生毛竹筍竹， 2018 年5 月初， 在毛竹出筍后生長至（3.0 ± 0.2） m 時， 分別在6 個時間點（10：00、 14：00、 18：00、 22：00、 2：00、 6：00）選取生境條件一致， 生長狀況良好， 基徑約15 cm 自然狀態下的毛竹筍竹， 從莖稈地上部分的基部將其伐倒， 將節間按照從基部至頂部的順序編號（1～N）。 每間隔2 個節間進行取樣， 從基部至頂部依次選取編號為1、 4、 7、 10、 13、 16、 19、 22 的節間。 取莖稈節間下部外層綠色組織， 取樣厚度為2 mm， 用于電鏡觀察樣品后， 取下， 迅速將樣品放進液氮中冷凍， 存于-80 ℃備用。 選取3 株筍竹， 每株作為1 個獨立實驗， 共3 次重復。

1.3 測定方法

1.3.1 電鏡樣品的制備與觀察 將筍竹的第4、 7、 10、 13 節間的莖稈切成0.2 mm × 5.0 mm 的小塊置于體積分數2.5%戊二醛溶液中， 4 ℃固定24 h。 然后， 將樣品置于0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（PBS, pH 7.0）中漂洗3 次， 15 min·次-1， 再置于質量分數1%鋨酸中固定2 h。 之后， 用PBS 緩沖液漂洗3 次固定材料后， 使用各級梯度乙醇（體積分數30%、 50%、 70%、 80%、 90%、 95%和100%）脫水處理15 min，過渡到純丙酮處理20 min； 在45 ℃下用環氧樹脂（Epon 812）浸透包埋經脫水處理的材料25 h， 之后在70 ℃條件下加熱聚合48 h； 使用LEICA EM UC7 型超薄切片機修整包埋樣品并切片， 再分別置于檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液雙染色10 min， 在Hitachi H-65 型（日本, HITACHI 公司）電鏡上觀察， 并拍照記錄結果。

1.3.2 引物設計 基于毛竹基因組數據庫中PeATG1 和PeATG4 的基因序列設計基因全長和定量引物，選擇毛竹PeNTB基因作為熒光定量的內參基因， 并使用在線網站Primer 3 設計引物（http：//bioinfo.ut.ee/primer3/）， 由有康生物科技公司合成（表1）。

表1 本研究所用的引物名稱Table 1 PCR primers used in this study

1.3.3 毛竹筍竹總RNA 的分離純化以及純度、 完整性檢測 分別取適量6 個時間段的毛竹筍竹莖稈第7 節間， 使用改良Trizol 法提取莖稈組織總RNA。 使用NanoDropRND-1000 分光光度計檢測樣品RNA的含量與純度， 并通過質量分數1.2%瓊脂糖電泳檢測樣品RNA 的完整性。

1.3.4 cDNA 合成 以上述RNA 為模板， 冰上配置20 μL RT-PCR 體系： 包括gDNA Eraser 1.0 μL， 5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL， RT Primer Mix 1.0 μL， Prime Script RT Enzyme MixⅠ1.0 μL， 5×PrimeScript Buffer 2 （for Real Time） 4.0 μL， 總RNA 500 ng， 加RNase Free dH2O 至總體積20.0 μL。 體系置于PCR儀中， 37 ℃孵育15 min， 85 ℃加熱5 s。 將通過反轉錄得到的cDNA 存于-20 ℃下用于實時熒光定量分析。

1.3.5 筍竹PeATG1 及PeATG4 基因全長cDNA 克隆 根據毛竹數據庫PeATG1 和PeATG4 基因序列設計基因全長引物（表1）， 擴增這2 個基因的系列片段， 擴增程序分別為： 94 ℃5 min； 94 ℃30 s， 52 ℃30 s， 72 ℃70 s， 共30 個循環； 72 ℃10 min。 通過質量分數1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增產物，送往有康生物科技公司測序。

1.3.6 自噬相關基因PeATG1 及PeATG4 反轉錄產物的基因表達分析 采用TaKaRa 公司SYBRRPremix Ex TaqTM（Perfect Real Time）試劑盒， 冰上配置20 μL 反應體系： 10 μL SYBR Premix ExTaqTM， 0.8 μL Forward Primer， 0.8 μL Reverse Primer， 2.0 μL 反轉錄cDNA 模版， 6.4 μL 滅菌蒸餾水。 反應于Bio-Rad CFX manager 3.1 PCR 儀上進行， 采用兩步法擴增標準程序： 95 ℃預變性3 min， 95 ℃下10 s、 60 ℃下30 s， 循環39 次。 以內參為對照， 每個樣品重復3 次。 反應完成后， 得到含所有樣品的記錄點曲線，得出循環閾值（Ct值）。

1.3.7 數據處理 所有數據均為3 次重復， 熒光定量數據按照公式計算： 相對表達量=2-ΔΔCt［34］， 使用內參基因校正拷貝數， 利用Origin 9.0 軟件進行統計分析和作圖。 統計方法采用單因素方差分析（one-way ANOVA）， 對筍竹PeATG1 及PeATG4 基因表達量分別進行Turkey 比較。

2 結果與分析

2.1 毛竹莖稈快速生長節24 h 自噬活性監測

使用透射電子顯微鏡監測毛竹莖稈第7 節間組織不同時間段的自噬活性（圖1）， 在10：00 和14：00的節間中觀察到大量淀粉粒存在， 未發現自噬體（圖1A 和圖1B）； 在18：00 的節間觀察到淀粉粒和自噬體（圖1C）； 22：00 第7 節中觀察到包裹有淀粉粒的自噬體（圖1D）； 2：00 第7 節中觀察到經典的雙層膜自噬體（圖1E）； 6：00 第7 節中未觀察到自噬體， 有少量淀粉粒（圖1F）。

圖1 毛竹莖稈組織自噬形成監測Figure 1 Monitoring of autophagy in stem of P. edulis

2.2 毛竹莖稈快速生長過程夜間自噬活性監測

對毛竹莖稈快速生長節24 h 自噬活性監測發現： 自噬活性在22：00 和2：00 較強， 進一步對22：00 和2：00 的毛竹莖稈不同節間組織第4、 7、 10、 13 節的自噬活性進行監測， 22：00 和2：00 第4 節中未觀察到淀粉粒和自噬體（圖1G 和圖1J）， 第7 節和第10 節中觀察到淀粉粒和自噬體 （圖1D、 圖1E、 圖1H和圖1K）， 第13 節中均未觀察到自噬體， 有大量淀粉粒（圖1I 和圖1L）。

2.3 毛竹莖稈PeATG1 和PeATG4 基因cDNA 全長克隆及驗證

以確定良好純度和完整度的毛竹莖稈總RNA 的反轉錄產物cDNA 為模板， 通過普通PCR 擴增PeATG1 及PeATG4 基因全長， 并通過質量分數1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物（圖2）， 條帶清晰且單一， 獲得與預期片段大小一致、 長度分別為392 和1 087 bp 擴增產物。

圖2 毛竹PeATG1 及PeATG4 基因cDNA 擴增電泳圖Figure 2 Electrophoresis map of PeATG1 and PeATG4 amplification

2.4 毛竹莖稈快速生長過程中PeATG1 基因表達模式

24 h 內毛竹莖稈PeATG1 表達變化量如圖3所示。PeATG1 在22：00 表達豐度最高， 2：00 和6：00 的表達豐度次之， 再次為10：00 和18：00 的表達量， 14：00 的表達量最低。 從18：00 開始， 毛竹莖稈PeATG1 表達量顯著增加， 到22：00 達到最高水平， 分別是14：00、 10：00、 18：00、 6：00 和2：00 的4.8、 3.1、 3.0、 1.3 和1.1 倍（P＜0.05）。 從10：00 到6：00，表達量總體呈先下降后上升再下降趨勢。PeATG1 在夜間的表達量顯著高于白天， 在2：00 及6：00 的表達量較22：00 有所下降， 但仍顯著高于白天。

2.5 毛竹莖稈快速生長過程中PeATG4 基因表達模式

24 h 內毛竹莖稈PeATG4 表達變化量（圖4）顯示：PeATG4 在2：00 表達豐度最高， 其次為22：00、 6：00和18：00， 再次為10：00， 14：00 的表達量最低。 毛竹莖稈PeATG4 表達量從18：00 開始增加， 到2：00 達最高水平， 分別是14：00、 10：00、 18：00、 6：00 和22：00 的3.8、 2.9、 1.7、 1.6 和1.5 倍（P＜0.05）。 從10：00到6：00， 表達量呈先下降后上升再下降的趨勢。PeATG4 在夜間的表達量顯著高于白天， 在6：00 表達量較2：00 顯著下降， 但仍顯著高于白天的水平。

圖3 不同時間毛竹PeATG1 定量分析Figure 3 Quantitative analysis of PeATG1 at different time

圖4 不同時間毛竹PeATG4 定量分析Figure 4 Quantitative analysis of PeATG4 at different time

3 討論

植物依靠光合作用獲得生命活動所需的能量與物質。 植物在黑暗條件下， 光反應不再進行， 但仍然需要營養用以維持生命活動、 細胞的基本結構與功能［35］。 此時， 淀粉的降解便為細胞有序進行夜間活動提供了能量來源。 除了淀粉降解的經典途徑外， WANG 等［15］研究發現： 植物細胞中的自噬能夠在葉片淀粉降解中發揮作用。 IZUMI 等［20］發現： 自噬可以通過夜間的碳代謝提供能源替代物如游離氨基酸來提高夜間的能源供應， 有助于植物生長， 證實自噬可以在夜間為植物提供能量。 本研究通過24 h 自噬活性監測， 在22：00 和2：00 毛竹竹筍第7 節莖稈組織中觀察到自噬體的存在， 而白天在相同部位未觀察到，表明自噬在夜間被激活。 同時在該部位中也有淀粉粒， 表明自噬可能與淀粉的分解有關， 通過分解淀粉提供能源， 促進毛竹夜間快速生長， 這與WANG 等［15］對擬南芥自噬體定量統計的研究相一致。 在監測了24 h 自噬活性， 確認自噬在夜間被激活后， 進一步在22：00 和2：00 對第4、 7、 10 和13 節進行夜間自噬監測， 不同部位的自噬活性存在差別。 毛竹莖稈下部表面包被的筍籜已逐漸脫落， 其組織中無淀粉粒和自噬體， 該部位已完成快速生長， 發育較為成熟， 為其上部組織的生長發育提供了營養物質運輸通道， 將竹篼中儲存的碳水化合物向上運輸至快速生長的部位， 供其代謝消耗所需； 中部正處于快速生長階段， 自噬體的存在為分解淀粉及其他胞內物質， 從而促進該部位快速生長提供了快速供能； 而莖稈上部較幼嫩， 尚未進入快速生長階段， 未觀察到自噬體。 在毛竹筍竹莖稈尚未萌發枝葉前的快速生長期內， 莖稈的光合能力較弱， 營養物質和能量主要來源于周圍的成竹［30］。 本研究結果表明： 在快速生長部位存在較多的自噬體， 可能對分解由周圍成竹通過竹鞭運輸至新生筍竹的碳水化合物的分解利用起到積極作用。 以上結果表明， 毛竹快速生長期， 莖稈中部較多的自噬體及其較強的分解淀粉能力可能是維持毛竹筍竹快速生長的原因之一。

自噬涉及廣泛的生理過程， 其生物學意義是通過關鍵基因組分之間的相互作用與各種細胞途徑相互作用來解釋的［36］。 ATG1 是細胞自噬過程中的重要蛋白， 與ATG13 形成ATG1/ATG13 蛋白激酶復合體，響應營養物質的需求， 起始自噬小體的形成； ATG4 對ATG8 的酶切加工是ATG8 進入類泛素連接系統的前提［37］。 因此， ATG1 和ATG4 是自噬過程的關鍵因子之一。 到目前為止， 在模式植物擬南芥和水稻中有關ATG1 和ATG4 基因的鑒定及其在細胞自噬過程中的功能研究比較集中。 擬南芥中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶ATG1 是調控自噬的關鍵組分ATG1/ATG13 蛋白激酶復合體的核心組分， 對自噬小體到液泡的轉運十分重要。 ATG8 耦合系統是自噬體成膜過程中的一個類泛素化系統， ATG8 蛋白在細胞自噬中發揮泛素化作用的前提是其蛋白前體的C 端經半胱氨酸蛋白ATG4 剪切后， 暴露其C 末端甘氨酸殘基［38］。結果表明：PeATG1 在夜間的表達加強， 顯著高于白天， 誘導自噬小泡形成。PeATG4 在夜間也增強表達， 顯著高于白天， 使自噬體得以形成來分解莖稈組織細胞內的淀粉， 滿足毛竹莖稈進行夜間生長所需的營養供給。 在白天毛竹主要進行光合作用合成營養物質供夜間持續生長所需， 與誘導自噬小泡形成有關的PeATG1 和調控自噬體形成的PeATG4 表達水平均較低。PeATG1 和PeATG4 基因的表達水平在適應黑暗的前4 h 內均有所上升，PeATG1 表達量在22：00 達到峰值，PeATG4 在2：00 達到最高表達水平，然后在白天下降到基礎水平， 這與WANG 等［15］對煙草Nicotiana tabacum夜間不同時間點ATG基因的表達變化的研究相一致。 以上結果表明： 這2 個ATG基因的轉錄水平在夜間顯示出不同的動態變化， 這表明潛在的細胞自噬機制是活躍的。

關于毛竹莖稈快速生長相關基因的研究， 李丹丹等［29］發現： 與海藻糖合成相關的PeTPS1 在夜間表達增強， 糖信號調控關鍵激酶PeSnRK1 在夜間表達量先升高后降低， T6P/SnRK1 信號共同調節筍竹夜間快速生長； 祝巧鳴等［39］發現： 與糖皮質激素代謝酶相關的11β-羥類固醇脫氫酶家族基因PeHSD1 在毛竹快速生長時期表達量最低， 與毛竹快速生長負相關； 葉家其等［40］發現： 大量的赤霉素類基因參與到毛竹的快速生長過程， 且對赤霉素關鍵基因進行表達分析， 發現GA20ox、GA3ox和GA2ox以及赤霉素受體GID1 和正調控基因GID2 都在竹筍的形態學上部有大量表達。 本研究中對PeATG1 及PeATG4 進行定量分析發現， 兩者在總體上趨勢一致， 均在夜間毛竹快速生長階段增強表達， 白天恢復至基礎水平， 表明PeATG1 和PeATG4 共同協調參與自噬過程， 進而調節毛竹莖稈快速生長。PeATG1 與PeATG4 在達到表達最高峰的時間點有所不同，PeATG1 在22：00 達最高表達水平，PeATG4 則在2：00 表達量最高，可能是由于它們在誘導自噬發生、 調控自噬體形成過程中發揮的作用不同。

綜上所述， 處于快速生長階段的毛竹莖稈內存在較高活性的自噬體和PeATG1 的PeATG4 基因表達量， 這為此時期莖稈中存在細胞自噬提供了有力證據。 自噬活性和PeATG1、PeATG4 的表達量隨時間由白天到黑夜呈現規律性變化， 表明毛竹莖稈不同時間段的生長發育存在明顯差異， 白天生長相對緩慢， 夜間生長迅速； 且不同節間的自噬活性也不相同， 表明毛竹莖稈不同節間的生長發育也存在明顯差異， 莖稈中部節間生長較快， 下、 上部節間生長相對緩慢； 莖稈中具有細胞自噬途徑， 參與調節莖稈的快速生長過程。 研究成果對明確毛竹速生生長機制具有參考價值。