黃薇花粉活力及柱頭可授性

羅卿清， 鄭 鋼， 顧翠花， 顧 帆， 陳 凱， 鄭紹宇

（浙江農林大學 風景園林與建筑學院， 浙江 杭州311300）

從有性生殖角度來看， 植物的生物學特性與傳粉條件相適應； 而有效的傳粉是以鮮花粉的活力、 可靠的傳播媒介和可授期的花朵柱頭為前提的［1］。 花粉持續活力的時間與柱頭可授期共同對植物的傳粉受精和植株發育起重要作用， 特別在異花授粉和遠緣雜交方面的影響程度更高［2］， 了解花粉培養、 儲藏及活力測定的方法是提高植物雜交育種效率的前提條件［3］。 黃薇Heimia myrtifolia為千屈菜科Lythraceae 黃薇屬Heimia灌木， 原產南美洲和非洲的熱帶、 亞熱帶地區， 人類的遷移致使南亞、 東亞地區有零星分布， 在中國上海、 廣西、 浙江等地均有引種， 用于園林觀賞及河道美化等方面。 對黃薇的研究主要集中在生物應用方面［4-5］， 目前未見黃薇在雜交育種方面的報道。 本研究采用花粉離體萌發法研究不同溫度、蔗糖質量濃度和硼酸（H3BO4）質量濃度對黃薇花粉萌發及花粉管生長的影響； 用聯苯胺-過氧化氫法測定柱頭可授性， 研究不同質量濃度萘乙酸（NAA）、 赤霉素（GA3）、 6-芐基腺嘌呤（6-BA）對黃薇柱頭可授性的影響， 并對黃薇花粉與柱頭進行電鏡掃描觀察， 為黃薇雜交育種親本選配提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

黃薇花單生葉腋， 花瓣5～6， 倒廣卵形， 長3～4 mm， 金黃色； 花萼鐘形， 裂片間有角狀附屬物；花、 果期7 月［6］。 于2014 年8 月由杭州植物園引進， 經過扦插繁殖成批量小苗種植于浙江農林大學東湖校區平山植物苗圃。 植株生長良好， 可正常開花結實。 試驗分別在2015 年7 月10-25 日， 2016 年7月12 日至8 月25 日進行。

1.2 方法

1.2.1 花粉采集 在7：00-8：00 采集黃薇未散粉的花藥置于干燥箱內干燥2 h， 常溫下自然散粉后過80目分子篩收集花粉。

1.2.2 花粉萌發培養基配制及培養 采用瓊脂培養基萌發法檢測花粉萌發率， 培養基于121 ℃高溫滅菌20 min， 冷卻至常溫后備用。 硼酸（H3BO4）處理： 以100.0 g·L-1蔗糖， 8.0 g·L-1瓊脂為基本培養基， 分別添加0、 0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5 g·L-1的硼酸， 在30 ℃下進行培養； 蔗糖處理： 以1.0 g·L-1的硼酸，8.0 g·L-1瓊脂為基本培養基， 分別添加0、 50.0、 100.0、 150.0、 200.0、 250.0 g·L-1的蔗糖， 30 ℃下培養； 溫度處理： 培養基為150.0 g·L-1蔗糖+ 20.0 mg·L-1H3BO4+ 20.0 mg·L-1CaCl2+ 100.0 g·L-1PEG 4000， 設置10、 15、 20、 25、 30、 35、 40 ℃共7 個溫度梯度， 3 種處理均將培養基滴加在凹形載玻片上， 采集的花粉用毛筆均勻撒在培養基上， 放置于鋪有濕潤濾紙的培養皿中， 蓋上保鮮膜， 置于光照培養箱內， 光照強度2 000 lx， 培養6 h。

1.2.3 柱頭采集及處理 柱頭采集和處理參考KHO 等［7］的方法， 提前選取即將開放、 松蕾情況相同、長勢良好的花朵， 標記掛牌， 次日清晨6：00 摘取黃薇鮮花， 用鑷子去除花瓣和雄蕊， 取出柱頭， 分別裝入含6-BA、 GA3、 NAA 等3 種植物生長調節劑溶液的5 mL 離心管中。 6-BA 的質量濃度設為1.0、5.0、 10.0、 15.0、 20.0 mg·L-1； GA3的質量濃度設為100.0、 200.0、 400.0、 600.0 mg·L-1， NAA 的質量濃度設為1.0、 5.0、 10.0、 15.0、 20.0 mg·L-1， 以蒸餾水浸泡為參照， 4 ℃保存12 h 后， 柱頭在4.0 mol·L-1氫氧化鈉（NaOH）溶液中常溫處理6 h， 經蒸餾水洗凈后用質量濃度為0.1%水溶性苯胺藍染色1 h。 摘取開花1、 2、 4、 6、 8、 12、 24 h 的黃薇花朵， 用鑷子取出柱頭， 用福爾馬林-乙醇-醋酸混合固定液（FAA）固定24 h， 其余染色步驟如上。

1.2.4 花粉萌發和柱頭可授性檢測 花粉萌發后在ZEISS Imager A2 熒光顯微鏡下觀察花粉萌發狀況，觀察不同視角花粉個數大于50， 重復5 次， 拍照并記錄， 花粉萌發率=（萌發花粉/花粉總數）×100%。 用聯苯胺-過氧化氫法測定柱頭可授性［8］。 將處理后的柱頭放入4.0 mol·L-1NaOH 溶液中常溫處理6 h， 浸入盛有聯苯胺-過氧化氫反應液（1%聯苯胺∶3%過氧化氫∶水為4∶11∶22， 體積比）染色1 h， 隨后取出并移置載玻片上， 滴加體積分數為50%中性甘油， 蓋片壓片， 用ZEISS Imager A2 熒光顯微鏡進行觀察［9］；反應液呈藍色并伴有少量的氣泡， 表明柱頭具有可授性； 反應液無變化， 則柱頭無可授性［10］。 每處理重復5 次， 并拍照。

1.2.5 花粉和柱頭的掃描電鏡觀察 黃薇花粉和柱頭經過硅膠干燥， 雌蕊經FAA 固定24 h 以上， 乙醇溶液梯度脫水。 臨界點干燥后， 固定于樣品臺上， 離子濺射儀鍍金， 在S-3700N Hitachi 掃描電鏡下觀察拍照。 選取5 個花粉或柱頭， 重復3 次。 利用Image-Pro plus 6.0， Photoshop CS6， SPSS 19.0 分析處理圖像及數據。

2 結果與分析

2.1 黃薇花粉萌發率觀察

2.1.1 溫度對黃薇花粉萌發的影響 由表1 可見： 花粉萌發率及花粉管長度在10～15 ℃呈上升趨勢， 15～35 ℃時花粉萌發率達25%～30%， 花粉管長度處于上升趨勢，在30～35 ℃時花粉萌發率和花粉管長度達最高值。 溫度為40 ℃時花粉萌發率和花粉管長度顯著下降， 且花粉萌發率降至最低， 干癟花粉粒數量增多， 花粉粒脫水嚴重。可見， 溫度對黃薇花粉萌發率影響較為顯著， 適宜的溫度為35 ℃。

2.1.2 硼酸質量濃度對黃薇花粉萌發的影響 由表2 可見： 硼酸質量濃度對黃薇花粉萌發率與花粉管生長影響差異顯著。 硼酸質量濃度為0～0.5 g·L-1時， 花粉萌發率和花粉管生長隨著硼酸質量濃度提高而呈上升趨勢， 花粉萌發率在0.5 g·L-1時達最高值為39.60%， 相較對照（24.20%）高出15.40%； 硼酸質量濃度為0.5～2.5 g·L-1時， 花粉萌發率和花粉管生長， 隨著硼酸質量濃度提高呈下降趨勢， 高于1.0 g·L-1時， 對黃薇花粉萌發和花粉管生長具有明顯抑制作用， 2.5 g·L-1時， 花粉萌發率與花粉管長度均降至最低， 花粉萌發率比對照降低了13.80%， 花粉管長度相比對照減少了102.67 μm。 因此，當硼酸質量濃度為0.5～1.0 g·L-1時， 對黃薇花粉萌發和花粉管生長具有明顯促進作用。

2.1.3 蔗糖質量濃度對黃薇花粉萌發的影響 由表3 可見： 不同質量濃度蔗糖對黃薇花粉萌發與花粉管生長的影響差異顯著。 蔗糖質量濃度為50.0 g·L-1時， 花粉萌發率和花粉管長達最大值， 花粉萌發率相比對照高出40.60%， 花粉管長度相比對照長308.86 μm。 黃薇花粉萌發及生長隨著蔗糖質量濃度上升呈下降趨勢， 在250.0 g·L-1降至最低， 花粉萌發率比對照低0.40%， 花粉管長僅為5.38 μm。 因此， 有效促進黃薇花粉萌發及花粉管生長的蔗糖質量濃度為50.0～150.0 g·L-1， 最佳蔗糖質量濃度為50.0 g·L-1。

表2 硼酸對黃薇花粉萌發和花粉管生長的影響Table 2 Effect of boric acid on pollen germination and pollen tube growth of H. myrtifolia

表3 蔗糖對黃薇花粉萌發和花粉管生長的影響Table 3 Effect of sucrose on pollen germination and pollen tube growth of H. myrtifolia

2.2 柱頭與花粉的掃描電鏡觀察

由圖1 可見： 柱頭平面為橢圓形， 中部明顯凹陷，輻射對稱， 表面密布不規則突起， 柱頭直徑為425.78～546.93 μm， 表面突起高度為24.42～29.13 μm； 花粉以多粒形式存在， 赤道面觀為橢圓形， 兩端鈍尖， 近極面和遠極面相同， 三裂圓形， 花粉表面平滑， 密布細孔， 極軸長為23.15～26.74 μm， 赤道軸長為18.02～20.03 μm， 花粉較小。

圖1 柱頭與花粉掃描電鏡觀察Figure 1 Scanning electron microscopic observation of stigma and pollen

2.3 柱頭熒光顯微鏡觀察

2.3.1 植物生長調節劑對黃薇柱頭可授性的影響 由圖2 顯示： 對照柱頭氣泡明顯低于6-BA 浸泡處理后的柱頭； 不同質量濃度6-BA 浸泡12 h 后， 柱頭周邊氣泡數量增多， 當6-BA 質量濃度為20.0 mg·L-1時， 柱頭氣泡數量明顯增多， 此時柱頭的可授性最好。 100.0～400.0 mg·L-1GA3處理的柱頭相較于對照氣泡增多， 柱頭可授性明顯提高； 當質量濃度達到600.0～800.0 mg·L-1時， 柱頭氣泡減少， 甚至停止反應， 氣泡消失。 200.0～400.0 mg·L-1GA3利于增強柱頭的可授性。 NAA 浸泡處理后的柱頭氣泡數隨著質量濃度增加呈現先升后降的趨勢， NAA 質量濃度為1.0 mg·L-1時柱頭反應最為劇烈， 氣泡最多； 1.0～10.0 mg·L-1范圍內， 柱頭可授性增強； 當NAA 質量濃度大于10.0 mg·L-1時柱頭反應減弱， 可授性降低， 20.0 mg·L-1時， 柱頭反應較低。

2.3.2 自然條件下黃薇柱頭可授性的動態變化 由圖3 可見： 在自然條件下， 黃薇在6：00 左右花瓣展開， 柱頭已經直立且伸出， 頂端呈嫩綠色； 11：00-12：30 柱頭開始產生黏液， 開花6 h 時柱頭上已粘染大量花粉： 開花24 h 時柱頭彎曲變褐色， 柱頭黏性消失； 開花48 h 時柱頭徹底萎蔫， 花瓣干枯掉落。 開花1～8 h 柱頭可授性逐漸增強， 在開花6～8 h 時柱頭可授性達到最強， 隨后下降， 開花24 h 的柱頭基本不產生氣泡。

3 討論與結論

花粉保持活力時間的長短， 同時受到遺傳基因和環境因素的影響［11］， 溫度過高或過低， 均會對花粉萌發生長產生影響。 本研究表明： 黃薇花粉在15～35 ℃條件下， 花粉萌發及生長良好， 10 與40 ℃時花粉萌發及生長受到抑制， 這與桃Prunus persica［12］和玉米Zea mays［13］中觀察到的現象一致。 多重因素對花粉的離體萌發產生影響， 其中蔗糖和硼酸是花粉萌發的重要因素。 本研究表明： 促進黃薇花粉萌發生長硼酸適宜質量濃度為0.5～1.0 mg·L-1， 蔗糖適宜質量濃度為50.0～150.0 mg·L-1， 這與四季報春Primula obconica花粉一致［14］。 柱頭可授期是植物花正常成熟的重要時期， 對花傳粉率及受精過程起著重要的作用［15-16］， 不同植物的柱頭可授期長短差異較大， 即使種內不同品種的植物柱頭可授期也有較大差異。 通過外源植物生長調節劑可有效提高柱頭可授性或促進柱頭增長。 本研究表明： 黃薇柱頭在開花48 h 時柱頭徹底萎蔫， 花瓣干枯掉落， 失去可授性。 通過6-BA、 GA3和NAA 等3 種植物生長調節劑處理能夠有效提高黃薇柱頭可授性， 20.0 mg·L-16-BA， 200.0～400.0 mg·L-1GA3及10.0 mg·L-1NAA 處理都可顯著提高黃薇柱頭可授性。 在雜交育種中花粉的結構、 大小對雜交授粉受精成功與否有著重要關系， 花粉粒與柱頭的結構性差異會直接造成雜交不親和問題［17-18］。 本研究表明： 黃薇花粉的赤道軸、 極軸長均小于30 μm， 屬于小型花粉， 如與其他屬植物進行遠緣雜交時， 應選擇黃薇作為父本， 并且盡量選取花型較小，柱頭較短的植物與黃薇進行雜交， 從而提高雜交成功率。

圖3 不同時段黃薇柱頭可授性Figure 3 Stigma receptivity of H. myrtifolia at different periods