急性低壓缺氧腦損傷大鼠腦組織海馬區HIF-1α時序性變化及意義

張文彬，蘇暢，張永亮，李建宇，李靈芝

(1天津醫科大學藥學院，天津300070；2武警后勤學院)

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急性低壓缺氧腦損傷大鼠腦組織海馬區HIF-1α時序性變化及意義

張文彬1，蘇暢2，張永亮2，李建宇2，李靈芝2

(1天津醫科大學藥學院，天津300070；2武警后勤學院)

摘要：目的觀察急性低壓缺氧大鼠腦組織海馬區缺氧誘導因子1α(HIF-1α)表達的時序性變化，探討其與缺氧性腦損傷的關系。方法將100只成年雄性SD大鼠隨機分為常氧對照組、低壓缺氧6 h組、低壓缺氧12 h組、低壓缺氧18 h組和低壓缺氧24 h組，每組20只。各低壓缺氧組置于低壓氧艙模擬海拔7 000 m高原環境。采用HE染色法觀察各組腦組織海馬區形態學改變，檢測腦組織含水量，一氧化氮合酶(NOS)活性及NO含量，反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測HIF-1α mRNA，免疫熒光化學染色法定位HIF-1α蛋白。結果①與常氧對照組比較，各低壓缺氧組腦組織海馬區神經細胞均有不同程度的水腫、壞死或凋亡，細胞質不規則紅染，核仁碎裂或消失，且海馬各區損傷程度不同，以CA1區最為嚴重；②與常氧對照組比較，各低壓缺氧組腦組織含水量均顯著上升(P均<0.01)，且隨缺氧時間的延長呈遞增趨勢；③與常氧對照組比較，各低壓缺氧組腦組織NOS活性均顯著升高(P均<0.01)；除低壓缺氧6 h組外，其余各組腦組織NO含量均隨缺氧時間的延長而顯著增加(P均<0.01)；④常氧對照組中未檢測到HIF-1α mRNA表達，各低壓缺氧組HIF-1α mRNA相對表達均顯著增加，且具有時間依賴性(P<0.01或<0.05)；常氧對照組腦組織海馬各區均未見HIF-1α蛋白陽性標記的綠色熒光，低壓缺氧損傷后先在部分神經細胞胞質中出現微弱熒光信號，隨著缺氧時間的延長熒光強度逐漸增強，并明顯呈向胞核聚集的趨勢。結論急性低壓缺氧可導致腦含水量升高，引發腦水腫，且損傷程度隨缺氧時間的延長而加重；HIF-1α的應激性表達對急性低壓缺氧性腦損傷有保護性調控作用。

關鍵詞：腦損傷；低壓缺氧性；一氧化氮；一氧化氮合酶；腦水腫；缺氧誘導因子1α；大鼠

大腦是機體耗氧量最高的器官，對缺氧的耐受性極低，低壓缺氧環境會引起大腦不可逆性損傷[1]。缺氧誘導因子1α(HIF-1α)是近年來缺氧相關領域的研究重點，其可通過調控紅細胞生成素(EPO)及一氧化氮合酶(NOS)等多種靶基因調節缺氧反應[2~4]，但目前關于急性低壓缺氧后腦組織海馬各區的損傷情況、HIF-1α的表達定位及時序性變化鮮見報道。2015年2～9月，我們觀察了急性低壓缺氧大鼠模型腦組織海馬各區在缺氧不同時間的損傷及HIF-1α表達情況，現分析結果，探討HIF-1α調控與大鼠缺氧性腦損傷的關系。

1材料與方法

1.1材料實驗動物：成年雄性SD大鼠(軍事醫學科學院實驗動物中心)100只，清潔級，體質量280~320 g。 主要試劑與儀器：多聚甲醛(上海化學試劑公司)；考馬斯亮藍G250試劑盒、NOS試劑盒、NO試劑盒(南京建成生物工程公司)；兔抗大鼠HIF IgG單克隆抗體(santa cruz公司)；正常兔血清(北京中杉生物有限公司)；FITC標記的羊抗兔IgG(北京鼎國生物有限公司)；抗熒光衰減封片劑(北京applygen公司)；TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0試劑盒、DL-2000 Markers(寶生物工程有限公司)；TRIzol Reagent(美國invitrogen公司)。低壓缺氧艙(煙臺宏遠氧業有限公司)；高速低溫離心機、核酸定量儀(Eppendorf公司，德國)；超低溫冰箱(Sanyo公司，日本)；組織切片機(Leica公司，德國)；E-510型多功能顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡(Olympus公司，日本)；PCR儀(MJ Research公司，美國)。

1.2動物分組與造模采用隨機數字表法將大鼠分為常氧對照組、低壓缺氧6 h組、低壓缺氧12 h組、低壓缺氧18 h組和低壓缺氧24 h組，每組20只。各組均飼養7天適應環境。各低壓缺氧組進入低壓缺氧艙進行低壓缺氧，缺氧時間按實驗要求；調節艙內壓力在20 min內降至真空度-0.06 mPa(相當于海拔7 000 m大氣壓力)。實驗過程中維持氧含量10%±2%，溫度(20±3)℃，濕度65%±5%。實驗結束20 min內使缺氧艙內升至正常氣壓。常氧對照組大鼠相同溫、濕度于艙外正常飼養。

1.3相關指標觀察

1.3.1海馬區腦組織形態學變化4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定大鼠腦組織，取海馬區組織石蠟包埋，連續切片，HE染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察。

1.3.2腦含水量用濾紙吸干腦水分，取左半球用預先稱重編號的錫紙包裹，稱得濕重，150 ℃恒溫烤箱中烘至恒重，冷卻后稱得干重，計算腦含水量。腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.3腦組織NOS活性及NO含量取上述右半球腦組織，按重量(g)∶體積(mL)=1∶9將腦與勻漿介質制成10%的勻漿，離心10 min(4 ℃、3 000 r/min)，吸取上清，以考馬斯亮藍法測定樣品蛋白含量，按試劑盒說明書的方法檢測樣品NOS活性及NO含量。

1.3.4海馬區HIF-1α mRNA表達采用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)法。取大鼠海馬區腦組織約100 mg，提取總RNA，紫外分光光度法檢測定量總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。按試劑盒操作說明反轉錄合成cDNA，產物進行PCR反應。反應條件為：HIF-1α：95 ℃ 2 min(預變性)；95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35個循環；72 ℃ 10 min；引物由Invitrogen公司合成，HIF-1α引物：上游：5′-ATACTGATTGCATCTCCATCTTCTACC-3′，下游：5′-TCAGTTAACTTGATCCAAAGCTCTGAG-3′，擴增產物長度為570 bp[4]；β-actin引物：上游：5′-TCCTAGCACCATGAAGATC-3′，下游：5′-AAACGCAG-CTCAGTAACAG-3′，擴增產物長度為180 bp[5]。取PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像分析系統進行處理分析，計算各組HIF-1α擴增帶吸光度(Af)與β-actin擴增帶吸光度(Ab)的比值作為HIF-1α mRNA的相對表達量。

1.3.5海馬區HIF-1α蛋白定位采用免疫熒光組織化學染色法。將海馬區腦組織石蠟切片以二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，0.01 mol/L PBS漂洗。37 ℃用0.4%胃蛋白酶消化30 min，0.01 mol/L PBS漂洗，冷風吹干置于濕盒，滴加10%兔血清封閉液室溫孵育30 min。滴加50 μL的1∶100稀釋的兔抗大鼠HIF-1α IgG單克隆抗體，4 ℃孵育過夜。室溫放置30 min后用0.01 mol/L PBS漂洗。避光條件下滴加50 μL稀釋度為1∶100的FITC標記的羊抗兔抗體，于37 ℃孵育45 min，0.01 mol/L PBS漂洗，用抗熒光衰減封片劑進行封片。激光共聚焦顯微鏡觀察、攝像，FITC的激發波長和發射波長分別為488 nm和520 nm。用PBS代替一抗在相同條件下進行空白對照實驗。FITC標記的HIF-1α蛋白陽性細胞出現綠色熒光。

2結果

2.1各組腦組織海馬區病理學改變光學顯微鏡下可見，常氧對照組海馬各區神經細胞飽滿，呈條索狀規則排列，胞質均勻，呈淡紅色，胞核呈淡藍色圓形或橢圓形，核仁清晰。低壓缺氧6 h組海馬CA1區可見部分神經細胞凋亡，皺縮成多邊形，胞質紅色深染，核仁消失；CA2、CA3及CA4區神經細胞損傷主要以水腫為主，部分細胞胞體腫脹，胞核腫大或消失，胞質淡染。低壓缺氧12 h、18 h及24 h組海馬各區神經細胞主要以凋亡或壞死為主，可見神經細胞數量明顯減少，呈不規則稀疏排列，大部分細胞胞核破碎，細胞間質中存在大量細胞碎片及凋亡小體，胞質深染；隨著缺氧時間的延長損傷逐漸加重，且海馬各區的損傷程度以CA1區最為嚴重，CA2、CA3及CA4區損傷逐漸減輕。見插頁Ⅰ圖2。

2.2各組腦含水量比較常氧對照組及低壓缺氧6、12、18、24 h組腦含水量分別為0.66±0.01、0.69±0.01、0.73±0.01、0.80±0.01、0.82±0.01，低壓缺氧18 h組>低壓缺氧12 h組>低壓缺氧6 h組>常氧對照組(P均<0.01)，低壓缺氧24 h組與低壓缺氧18 h組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3各組腦組織NOS活性及NO含量比較與常氧對照組比較，各低壓缺氧組腦組織NOS活性均顯著升高(P<0.01)，在缺氧12 h后達到最大值，低壓缺氧18 h、24 h組與12 h組相比呈下降趨勢；與常氧對照組比較，除低壓缺氧6 h組外，其余各低壓缺氧組腦組織NO含量均顯著增加(P均<0.01)，隨著缺氧時間的延長，NO含量逐漸增加；見表1。

表1　各組腦組織NOS活性與NO含量比較±s)

注：與常氧對照組比較，*P<0.01；與低壓缺氧6 h組比較，△P<0.05，□P<0.01；與低壓缺氧12 h、18 h組比較，※P<0.01。

2.4各組腦組織海馬區HIF-1α mRNA表達比較常氧對照組海馬區未檢測到HIF-1α mRNA，低壓缺氧6、12、18、24 h組HIF-1α mRNA相對表達量分別為0.85±0.06、1.39±0.09、1.86±0.13、1.98±0.20，兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.01或<0.05)；見圖1。

注：M為Marker；1為常氧對照組；2~5分別為低壓缺氧6、12、18、24 h組。

圖1各組腦組織海馬區HIF-1α mRNA表達

2.5各組腦組織海馬區HIF-1α蛋白定位比較常氧對照組海馬各區均未出現HIF-1α陽性信號；低壓缺氧6 h組HIF-1α在海馬各區部分神經細胞胞質中大量表達；隨著缺氧損傷時間的延長，在低壓缺氧12 h組海馬區大部分神經細胞胞核及胞質中均可觀察到HIF-1α陽性信號；雖然在低壓缺氧18 h和24 h組中大量神經細胞凋亡、壞死，胞核破碎，但在胞核區仍可見HIF-1α陽性信號；見插頁Ⅰ圖3。

3討論

腦是人類各種生命活動的“指揮官”，對氧及能量的需求量很大，且自身并無儲備功能，因此各種因素導致的腦缺氧都會使腦組織很快出現代謝功能障礙，引起神經細胞凋亡、壞死，最終導致不可逆性腦損傷。研究表明，缺氧會影響大鼠腦學習和記憶功能[5~8]。Mishra等[9]等研究發現，與其他原因導致的腦損傷不同，負責學習和記憶等功能的海馬體對缺氧性損傷比腦皮質更為敏感。本實驗也發現，海馬各區神經細胞損傷程度隨著缺氧時間的延長而加重，均出現不同程度的凋亡或壞死，細胞數量明顯減少；且海馬各區損傷程度不同，以CA1區損傷最嚴重，CA2、CA3及CA4區損傷程度逐漸減輕，提示CA1區是海馬體對缺氧最為敏感的部位，與Kihara等[10]觀察到的結果相符。

急性缺氧容易引起腦水腫，腦水腫是引起顱內高壓的重要原因，參與了缺氧性腦損傷的許多病理生理過程。張艷超等[11]采用Morris水迷宮試驗觀察了低壓缺氧腦損傷模型大鼠的學習記憶功能，結果發現急性低壓缺氧可導致大鼠腦水腫，從而影響大鼠學習和記憶能力。本研究結果證實低壓缺氧后大鼠腦含水量隨缺氧時間的延長逐漸增加，說明腦水腫隨著低壓缺氧的持續逐漸加重。值得注意的是，病理染色結果顯示急性低壓缺氧后腦海馬區神經細胞首先表現為水腫，隨低壓缺氧時間的延長，神經細胞出現凋亡和壞死，而腦含水量測定結果顯示腦水腫程度逐漸加重，提示急性低壓缺氧后腦水腫可能主要發生在大腦皮質等部位，而非海馬區。

在腦缺氧損傷過程中，HIF-1α起到至關重要的作用。在常氧狀態下，受脯氨酰羥化酶(PHD)的調控HIF-1α不表達或低表達，缺氧時PHD的調控受阻，HIF-1α得以聚集入核與HIF-1β結合激活下游基因，通過調控包括EPO及NOS等多種靶基因來調節缺氧反應[12]。NO在腦缺血損傷中的作用一直倍受爭議。研究表明，腦內NO既有神經保護作用，又有神經毒性作用，而其發揮何種作用與其濃度及由何種類型NOS催化生成密切相關[13,14]。NOS分為三種類型：內皮型(eNOS)、神經型(nNOS)以及誘導型(iNOS)，eNOS活性增加可能具有神經細胞保護作用，而nNOS及iNOS活性增加則可能具有神經毒性作用。大量研究表明，HIF-1α可通過調節NOS的活性從而影響NO生成量，對缺氧損傷起到保護作用[15]。本研究結果表明，常氧對照組HIF-1α mRNA無表達，低壓缺氧6 h后開始出現表達，且隨缺氧時間的延長表達逐漸升高；免疫熒光組織化學染色結果顯示常氧對照組中海馬各區均未出現HIF-1α陽性信號，缺氧后各組大鼠腦海馬區均可見HIF-1α陽性信號，首先在胞質出現陽性表達，缺氧12 h，與常氧對照組相比顯著增加，且隨缺氧時間的延長呈遞增趨勢；與常氧對照組相比，各低壓缺氧組腦組織中NOS活性均顯著升高，在缺氧12 h后達到最大值，缺氧18、24 h呈下降趨勢。根據以上結果結合文獻報道，推測缺氧早期大腦應激使得腦組織NOS活性升高，NO含量增加，后者激活HIF-1α；缺氧12 h后，HIF-1α轉移入核，調控NOS活性，影響NO生成，發揮腦保護作用。總之，HIF-1α的應激性表達可能是對急性低壓缺氧性腦損傷的保護調控。

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Temporal changes of HIF-1α and rat brain hippocampus injury induced by acute hypobaric hypoxia

ZHANGWenbin1,SUChang,ZHANGYongliang,LIJianyu,LILingzhi

(1TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the temporal changes of hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) in rat brain hippocampus after acute hypobaric hypoxia and to explore the relationship between the changes and brain injury. MethodsWe randomly divided 100 male SD rats into the normoxic control group and hypoxia injury groups. The rats of hypoxia injury groups were further divided into four subgroups (6 h, 12 h, 18 h and 24 h) on the basis of the duration in hypobaric hypoxia and 20 rats in each group. Except the control group, other four subgroups were placed in hypobaric chamber imitating a plateau of 7000 meters. After hypobaric hypoxia injury, the morphological changes of hippocampus were observed by HE staining. The brain water content, the level of NO and the activity of nitric oxide synthase (NOS) were detected. The expression of HIF-1α mRNA was detected by RT-PCR and HIF-1α mRNA protein was detected by immunofluorescence staining. Results①Compared with the control group, after hypobaric hypoxia, the neurocytes in the hippocampus showed varying degrees of swelling, necrosis, apoptosis and karyorrhexis or karyolysis. The cytoplasm was stained with inhomogeneous oxyphilic red colour. The CA1 in hippocampus was more sensitive to hypobaric hypoxia than the others. ②Compared with control group, the brain water content was significantly increased in a time-dependent manner in the subgroups (all P<0.01). ③Compared with the control group, the activities of NOS in each subgroup was increased (all P<0.01). Meanwhile, except the 6 h group, the levels of NO in each subgroup was increased in a time-dependent manner (all P<0.01). ④The expression of HIF-1α mRNA was not detected in the control group. Compared with the control group, the expression of HIF-1α was significantly increased with a time-dependent manner in the subgroups (P<0.01 or P<0.05). The results of immunofluorescence showed no green fluorescence of HIF-1α protein was found in hippocampus of the control group. After hypobaric hypoxia, a weak green fluorescence appeared in part of cytoplasm at first, but with prolonged hypoxia time, a gradually enhanced fluorescence was observed and it showed a trend of aggregating to the nucleus. ConclusionsAcute hypobaric hypoxia increased the brain water content and led to cerebral edema and the extent of damage was aggravated with prolonged hypoxia time. Stressful expression of HIF-1α played an important role in protective regulation of cerebral injury induced by acute hypobaric hypoxia.

Key words:brain injures; hypobaric hypoxia; nitric oxide; nitric oxide synthase; brain edema; hypoxia-inducible factor-1α; rat

(收稿日期：2015-08-15)

中圖分類號：R742

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)04-0008-04

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.04.003

通信作者簡介：李靈芝(1963-)，女，博士生導師，教授，主任，主要研究方向為缺氧損傷及其防治。E-mail： 13682196000@163.com

作者簡介：第一張文彬(1990-)，男，碩士研究生，主要研究方向為抗缺氧藥物研究。E-mail： llzhx@aliyun.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81471823)；天津市重點基金資助項目(12JCZDJC34700)。