黃芪多糖對硫酸吲哚酚誘導的心肌細胞損傷的保護作用

吳 進，劉 廣，傘 勤，鄭敏麟*，江 澍*

(1.福建中醫藥大學 中西醫結合研究院，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州 350122)

心血管疾病(cadiovascular disease，CVD)在慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)人群中是非常普遍的，研究表明33%的CKD患者同時患有CVD[1]。且當CKD患者出現心血管病變時，死亡的風險將會變得更大[2]。而引起CKD患者發生CVD的因素有很多，除了傳統的心血管系統的危險因素[3]，如高血壓、高血脂、高膽固醇外，越來越多的證據表明尿毒癥毒素[4]可能是CKD中CVD發生的罪魁禍首。而硫酸吲哚酚(Indolophenol sulfate，IS)是一種與蛋白質結合的小分子化和類尿毒素[5]，可以通過誘導全身氧化應激狀態，造成心血管損害[6]，進一步引起心肌細胞變性，最終導致細胞凋亡。因此，抑制IS所誘導的氧化應激損傷可能能夠減輕心肌細胞損傷，從而達到減緩CKD中CVD的發生。

黃芪，又名棉芪，是一種多年生草本植物，藥用歷史已有兩千多年，最早被《神農本草經》記錄在冊，常被用在補氣升陽、利尿脫毒等用途。黃芪的主要活性成分有黃芪多糖、黃芪皂甙、葉酸、黃芪黃酮及多種氨基酸等，其中，黃芪多糖得到了廣泛關注[7]。黃芪多糖屬于生物大分子成分，具有多種功能，而根據孫成文等[8]的研究，黃芪多糖可以改善心肌收縮性能并有效緩解心肌因氧化損傷而導致的損害。筆者根據以上特性，在本實驗中通過在細胞層面利用黃芪多糖干預被硫酸吲哚酚損傷的大鼠心肌細胞，來探討黃芪多糖對硫酸吲哚酚誘導的大鼠心肌細胞氧化損傷的保護作用。

1 材料

1.1 藥品和試劑

硫酸吲哚(sigma公司)；黃芪多糖(北京索萊寶科技有限公司)；F12培養基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清(HYCLONE公司)；MTT、電泳液、轉膜液、上樣緩沖液、TBS(武漢博士德生物工程有限公司)；Caspase-3、Caspase-9引物(Servicebio公司)。

1.2 細胞株

H9c2細胞株購自中科院上海生科院細胞資源中心。

1.3 主要儀器與設備

二氧化碳培養箱(美國Thermo公司)；熒光倒置顯微鏡(日本尼康公司)；臺式低速離心機(美國Thermo公司)；電子天平(美國奧豪斯公司)；-80 ℃超低溫冰箱(德國艾本德股份公司)；小型垂直電泳槽，超高靈敏化學發光成像系統，實時熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)。

2 方法

2.1心肌細胞培養

將H9c2細胞株置于DEMM/F12完全培養基中，放在細胞培養箱中培養，當細胞密度達到85%～95%時，用胰蛋白酶消化，按1∶3比例進行傳代培養。

2.2CCk8法檢測不同劑量黃芪多糖對硫酸吲哚酚導致損傷的心肌細胞的作用

將細胞消化下來后，利用完全培養基稀釋成細胞懸液，在96孔板中每個孔加入100 μL的細胞混懸液，將96孔板放入37 ℃、5%CO2的培養箱中培養24 h。24 h后向培養板加入不同濃度的黃芪多糖，24 h后再加入硫酸吲哚酚。再將培養板置培養箱孵育24 h。24 h后向每孔加入10 μL CCK8溶液，再在培養箱孵育3 h。酶標儀測定在450 nm處的吸光度。細胞活力(%)=(加藥組OD-空白組OD)/(對照組OD-空白組OD)

2.3 利用熒光分光光度計檢測各組細胞ROS水平

按1∶1 000用無血清培養液稀釋DCFH-DA，使最終濃度為10 μmol/L。去除細胞培養液，加入稀釋好的DCFH-DA。37 ℃細胞培養箱內孵育20 min。用無血清細胞培養液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。收集細胞后用熒光分光光度計檢測各組細胞ROS水平。

2.4RT-qPCR檢測各組細胞Caspase-3，Caspase-9mRNA表達水平

將細胞接種至6孔板中，經過藥物處理后，吸去原來的培養基，然后在各孔加入1 mL的Trizol，提取RNA，然后利用反轉錄酶將mRNA反轉錄成cDNA，以cDNA為模板建立RT-qPCR反應體系，PCR引物序列見表1，設定反應程序如表2所示。

表1Caspase-3、Caspase-9引物序列

表2 反應程序

2.5western blot檢測各組細胞Caspase-3，Caspase-9蛋白表達水平

將細胞從6孔板上消化下來后，加入細胞裂解液，裂解H9c2細胞，4 ℃離心后，取上清液即為蛋白樣品，在收集的蛋白樣品中加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴加熱3 min。冷卻到室溫后，上樣及電泳，電泳完成后，用PVDF膜轉膜。轉膜完畢后，加入5%BSA封閉液，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉60 min。封閉完成后將條帶放入到含一抗的自封袋中，4 ℃過夜。第二天取出后放入TBST中清洗5～10 min。共清洗3次。清洗完成后將膜放入含二抗的自封袋中，室溫在搖床上緩慢搖動孵育1 h。孵育完成后，TBST清洗，共清洗3次。之后加入顯影液，上機檢測條帶，讀取灰度值。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 黃芪多糖對硫酸吲哚酚誘導的H9c2細胞活力的影響

實驗結果顯示，與空白對照組比較，硫酸吲哚酚組的細胞活力顯著降低，差異有明顯的統計學意義(P<0.01)。而與模型組比較，黃芪多糖50、100、200 μgl/mL給藥組細胞活力明顯升高，差異均有明顯的統計學意義(P<0.01)。見表3。

表3 黃芪多糖對硫酸吲哚酚誘導的H9c2細胞活力的影響

注：與空白對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01。

3.2 黃芪多糖對硫酸吲哚酚誘導的H9c2細胞內ROS的影響

實驗結果顯示，與空白對照組比較，硫酸吲哚酚組的ROS水平顯著上升，差異有顯著統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，黃芪多糖50、100、200 μgl/mL給藥組細胞內ROS明顯下降，差異均有顯著統計學意義(P<0.01)。見表4。

表4 黃芪多糖對硫酸吲哚酚誘導的H9c2細胞內ROS的影響

注：與空白對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

3.3 各組心肌細胞內Caspase-3、Caspase-9mRNA的表達水平

實驗結果顯示，與空白對照組比較，硫酸吲哚酚組的Caspase-3、Caspase-9的mRNA表達水平均上升，差異均有顯著統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，黃芪多糖50、100、200 μgl/mL給藥組中Caspase-3、Caspase-9的mRNA表達水平均明顯下降，差異均有顯著統計學意義(P<0.01)。見表5。

分組Caspase-3/GAPDHCaspase-9/GAPDH空白對照組1.02±0.261.00±0.04硫酸吲哚酚組6.10±0.17**5.11±0.56**硫酸吲哚酚+黃芪多糖50μg/mL組4.22±0.14△△3.23±0.11△△硫酸吲哚酚+黃芪多糖100μg/mL組4.07±0.18△△2.28±0.14△△硫酸吲哚酚+黃芪多糖200μg/mL組3.78±0.34△△1.69±0.02△△

注：與空白對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01。

3.4 各組心肌細胞中Caspase-3、Caspase-9蛋白的表達水平

western blot實驗結果顯示，與空白對照組比較，硫酸吲哚酚組的Caspase-3、Caspase-9的蛋白表達水平均上升，差異均有顯著統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，黃芪多糖50、100、200 μgl/mL給藥組中Caspase-3、Caspase-9的蛋白表達水平隨著黃芪多糖濃度的增加呈逐漸下降的趨勢，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1，表6。

注：A為空白對照組；B為硫酸吲哚酚組；C為硫酸吲哚酚+黃芪多糖50 μg/mL組；D為IS+黃芪多糖100 μg/mL組；E為IS+黃芪多糖200 μg/mL組。

圖1 各組心肌細胞中Caspase-3、Caspase-9蛋白的表達區別

分組Caspase-3/β-actinCaspase-9/β-actin對照組0.29±0.070.41±0.15硫酸吲哚酚組0.64±0.04**0.83±0.25**硫酸吲哚酚+黃芪多糖50μg/mL組0.43±0.07△△0.53±0.12#硫酸吲哚酚+黃芪多糖100μg/mL組0.36±0.04△△0.46±0.05#硫酸吲哚酚+黃芪多糖200μg/mL組0.35±0.05△△0.43±0.09##

注：與空白對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01；#P<0.05，##P<0.01。

4 討論

尿毒癥毒素的積累是CKD進展的標志之一。由于CKD本質上是一種進行性疾病，如果不采取干預措施，尿毒癥毒素的滯留會隨著時間的推移而惡化，從而加劇CVD的發生，最終引發死亡。由此可見尿毒癥毒素是CVD的罪魁禍首。而IS屬于可與蛋白質結合小分子尿毒素，它通過與蛋白質的結合作用，以增強其他尿毒癥毒素的作用，加速腎衰竭及其他由尿毒癥毒素引發的損害，如尿毒癥毒素所帶來的心腦血管損害[6]。根據吳禹池等[9]的研究，IS對心血管的損傷在于：使血管發生不同程度的鈣化；使心肌細胞間的膠原增生和導致細胞肥大；使血管內皮細胞的功能發生障礙。其中，IS通過誘導血管內皮細胞產生氧化應激，增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產生，從而導致心肌細胞的凋亡。與此同時，有研究表明，ROS的過量累積會導致細胞凋亡[9]，它同時也是監測氧化損傷的重要指標[10]。除此之外，根據線粒體凋亡途徑的理論，當細胞凋亡開啟后，凋亡信號會引起線粒體釋放出細胞色素C，釋放出的細胞色素C與胞質中的Apaf-1結合之后能活化Caspase-9，并進一步活化凋亡通路的下游分子Caspase-3，從而介導一系列的細胞凋亡過程[11]。

由于IS引起的氧化應激能夠導致心肌細胞損傷，最終引發心血管病變。因此，尋找有效藥物抑制IS引起的氧化應激損傷將意義重大。而中醫中藥作為人類文化的瑰寶，解決這一難題的潛力巨大。黃芪作為一味歷史悠久的中藥，它的有效成分以及藥用價值被廣泛關注。其中，黃芪經過提取分離得到的黃芪多糖，被證實有眾多功效：①免疫調節作用及抗腫瘤作用[12]；②抗衰老作用[13]；③保護心血管[14]等作用。其中，王意蘭[15]通過實驗證明黃芪多糖能夠減少心肌組織氧自由基的表達，調節組織中抗氧化系統的功能及平衡氧化系統，從而發揮心肌細胞的保護作用，即減少心肌細胞的凋亡。

本次實驗針對黃芪多糖的抗氧化損傷，減少細胞凋亡的作用，利用不同濃度的硫酸吲哚酚對H9c2細胞進行干預，通過檢測各組細胞ROS水平、Caspase-3、Caspase-9的mRNA表達水平，及細胞Caspase-3、Caspase-9蛋白表達水平，說明硫酸吲哚酚可能通過引起氧化應激從而誘導H9c2細胞損傷，而黃芪多糖可能通過降低ROS水平，以及降低H9c2細胞中Caspase-3、Caspase-9基因及蛋白表達水平，從而改善硫酸吲哚酚對H9c2細胞的損傷，起到保護H9c2細胞的作用。