夏枯草抗阿爾茨海默病的成分-靶點-通路的網絡藥理學研究

彭 壯，彭 莎，何超平，徐 佳，肖 嵐，廖端芳，2*，李亞梅，2*

(1.湖南中醫藥大學 藥學院 湘產大宗藥材品質評價湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208；2.湖湘中藥資源保護與利用協同創新中心，湖南 長沙 410208)

夏枯草，為唇形科夏枯草屬植物夏枯草PrunellavulgarisL.的干燥成熟果穗[1]，最初記載于《神農本草經》，其味苦、辛，其性寒，具有清肝瀉火、明目、散結消腫之功，已知其含有的主要化學成分有多糖類、有機酸類、黃酮類、三萜及其苷類、甾體類、揮發油類等，已報道的藥理作用主要有降糖、降壓、抗菌、抗炎、抗腫瘤、免疫抑制、抗氧化以及抑制病毒生長，臨床上主要用于目赤腫痛、目珠夜痛、頭痛眩暈、瘰疬、癭瘤、乳癰、乳腺癌、高血壓、腮腺炎、浸潤性肺結核等，作為一種藥食同源的草本植物，至今已經有幾千年的藥用歷史。

阿爾茨海默病(Alzheimer，s disease，AD)是一種以進行性認知功能減退，嚴重影響日常活動為主要特征的神經退行性疾病[2]。目前全世界有近4 680萬AD患者，到2050年估計會達到1.3億人[3]。AD作為一種社會疾病，給社會和患者家庭帶來了沉重的負擔，從2000年消耗在AD患者的醫療費用180億美元增加到2010年的6 000多億美元。據估計，到2050年費用將增加到1.2萬億美元[4]，已經成為影響全球的嚴重疾病并且受到全球所有相關研究人員的高度關注。AD的病理特征包括β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)的堆積，神經原纖維纏結和神經元的丟失[5]，有證據顯示Aβ的堆積與載脂蛋白(apolipoprotein，ApoE)和炎癥有著密切的關系[6-7]，它們共同參與AD的病程發展，也有研究表明使用抗炎藥物可降低AD的發病率[8]，但目前并沒有確切有效的抗炎藥物在臨床中報道出來。

目前有關夏枯草化學成分、藥理機制及臨床應用的研究不斷涌現[9-10]，但未見整體系統地分析夏枯草中成分、靶點、通路和阿爾茨海默病的相互關系的報道。隨著生物信息學、分子生物學、計算機技術的不斷發展和聯合應用，以及網絡藥理學[11]、整合藥理學[12]等概念的逐步提出，這也為中醫藥科學的研究提供了新的思路與方法[13-14]，利用其整合生物信息學、分子生物學及各大數據庫信息，系統地研究“藥物-靶點-通路-疾病”之間的相互作用，探究中醫藥“多成分、多靶點、多途徑”的藥理機制，與中醫藥的整體觀、辨證論治、組方配伍、協同增效等原則不謀而合[15]。本研究旨在利用網絡藥理學方法，探索夏枯草的主要物質基礎、核心靶點及與阿爾茨海默病之間可能存在的相互關系，為后續進一步闡明夏枯草抗阿爾茨海默病的作用機制提供思路和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 數據庫和軟件

TCMSP數據庫(http：∥lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)；

TCMID數據庫(http：∥119.3.41.228/tcmid/search/)；

STITCH數據庫(http：∥stitch.embl.de/)；

STRING數據庫(https：∥string-db.org/)；

Cytoscape3.7.1軟件；

Pubchem數據庫(https：∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；

TTD數據庫(http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)；

DisGeNET數據庫(http：∥www.disgenet.org/)；

UniProt數據庫(https：∥www.uniprot.org/)；

Metascape數據庫(http：∥metascape.org/gp/index.html#/main/step1)。

1.2 方法

1.2.1 夏枯草活性成分檢索與篩選 通過在TCMSP數據庫(中藥系統藥理學分析平臺，http：∥lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)上檢索夏枯草的化學成分，再根據藥物的ADME(吸收、分布、代謝及排泄)相關特性，并且以多篇相關文獻標準為參考，選擇將夏枯草化學成分的口服利用度(OBioavail，OB)以及類藥性(drug-likeness，DL)作為活性成分篩選的關鍵參數[16]，從而篩選出滿足口服利用度OB>30%且類藥性DL>0.18的化合物作為夏枯草潛在活性成分。同時，由于藥物在機體內的吸收利用不只有口服一種途徑，加之口服利用度低的能做成其他不同劑型，因此，應用TCMID數據庫和文獻檢索，補充夏枯草中的其他有效成分。最后將篩選出的夏枯草潛在活性成分在Pubchem數據庫中查詢其結構式，并使用SMILES表達式。

1.孩子們大多已經入門，基本上能寫出像模像樣的對聯來；共創作出對聯一兩百副，創作了不少好對子，得到親友好評。

1.2.2 夏枯草活性成分靶點挖掘 使用TCMSP靶點查找夏枯草潛在活性成分的作用靶點，并在Uniprot數據庫中將查找到的所有靶點蛋白名轉換為相應的基因名。使用Cytoscape3.7.1軟件對夏枯草的活性成分以及作用靶點進行相關網絡構建。

1.2.3 疾病相關基因檢索 使用TTD數據庫和DisGeNET數據庫中檢索阿爾茨海默病(Alzheimer′s Diseases)的靶基因，將重復項去除，并查閱阿爾茨海默病靶基因的相關文獻[17-20]，匯總阿爾茨海默病基因，并在UniProt數據庫中進行基因和蛋白的轉換。

1.2.4 蛋白互作網絡構建 將“1.2.2”和“1.2.3”得到的蛋白一并導入STRING數據庫，選擇物種為“Homo sapiens”進行計算，最低相互作用閥值設為中等“medium confidence=0.4”，構建靶點群蛋白互作網絡(protein protein interaction network，PPI network)[21]，即“夏枯草-靶點-阿爾茨海默病”網絡。

1.2.5 關鍵靶點的篩選 使用Cytoscape對PPI網絡進行拓撲屬性分析，計算網絡整體的“介數中心性(Betweenness Centrality)和節點度值分布(Node Degree Distribution)”，并將Degree、Closeness和Betweenness的均數作為“閾值”，選取3個參數同時都在閾值之上的靶點為“關鍵靶點”，研究篩選出關鍵靶點可能存在的藥理作用。

Degree指網絡節點和其他節點的連接數目；Betweenness為網絡中出現所有最短路徑中經過該節點的路徑數目和最短路徑總數的比值；Closeness為通過節點之間的傳遞距離對節點的重要度進行衡量。三者是衡量一個節點在網絡中重要性的主要拓撲參數，也是判斷一個靶蛋白是否為“關鍵靶點”的重要依據[22]。

1.2.6 關鍵靶點的代謝通路與生物過程分析 為了進一步研究夏枯草可以抗阿爾茨海默病的相關作用情況，擬使用Gather平臺對夏枯草的抗阿爾茨海默病靶點群，進行GO生物過程富集分析，詮釋夏枯草靶點的抗阿爾茨海默病生物過程，再進行KEGG代謝通路富集分析，研究夏枯草抗阿爾茨海默病的主要代謝通路。Gather數據庫中的列表與背景均設置“Homo Sapiens”(人類)進行操作。

2 結果

2.1 夏枯草活性成分

在TCMSP數據庫中查詢得到夏枯草活性成分11個，在TCMID數據庫和文獻檢索得到另8個活性成分，共19個活性成分(見表1)。

表1 夏枯草活性成分

2.2 夏枯草活性成分靶點

通過Cytoscape3.7.1軟件得到夏枯草活性成分-作用靶點的網絡圖，19個橢圓形表示夏枯草的活性成分(M1～M19代表的化合物見表1)，253個不規則四邊形為活性成分作用靶點，共有540條邊代表靶點和化學成分之間的相互作用(見圖1)，體現了夏枯草多成分、多靶點的特點。

圖1 活性成分-靶點網絡

2.3 阿爾茨海默病相關基因

在TTD數據庫和DisGeNET數據庫中檢索阿爾茨海默病(Alzheimer′s Disease)的靶基因，共得到2 021個基因(其中TTD中檢索到86個基因，DisGeNET中檢索到1 981個，有46個重復)。

2.4 蛋白間相互作用網絡構建

在TTD數據庫和DisGeNET數據庫中檢索到阿爾茨海默病(Alzheimer′s Disease)的靶基因與夏枯草作用的靶基因有136個重復，這136個靶基因可能為夏枯草抗阿爾茨海默病的靶點。為研究各靶點在體內的相互作用關系，尋找核靶點，將潛在靶點蛋白群進行PPI網絡分析(見圖2)，結果共發現136個靶蛋白發生相互作用，產生2 440條代表蛋白之間相互作用的邊。

圖2 靶蛋白PPI網絡

2.5 核心靶點的分析結果

通過Cytoscape計算得到，PPI網絡平均度值為21，平均介數為1.44×10-2，平均緊密度為0.47，度值、介數和緊密度均超過平均值的靶蛋白共有39個，說明這39個靶點在PPI網絡中處于關鍵位置，很可能是夏枯草抗阿爾茨海默病的關鍵靶點(見圖3)。

此外，發現夏枯草的19種活性成分中的16種活性成分可能有抗阿爾茨海默病的作用，且其中M3(Quercetin)、M8(Kaempferol)、M12(Luteolin)、M13(wogonin)、M15(ursolic acid)、M19(Rosmarinic Acid)共6種活性成分可能為抗阿爾茨海默病的關鍵化合物。

注：最中間矩形為夏枯草，橢圓形為夏枯草活性化合物，菱形為夏枯草關鍵活性化合物，近菱形不規則四邊形為關鍵靶點，最外側不規則四邊形為靶點。

圖3 夏枯草(PV)有效成分靶標關聯網絡

2.6 Metascape分析KEGG和GO的結果

根據P值(校正)<0.01的標準，在Metascape數據庫對39個關鍵靶點進行計算分析，最終得到關鍵靶點的相關通路信息。其中主要包括白介素信號通路、細胞對應激反應信號通路、PIP3激活AKT信號通路等，見圖4和表2。

A.

表2 關鍵靶點的信號通路

4 討論

本研究采用網絡藥理學對夏枯草的主要活性成分、作用靶點、相關生物信號通路及對阿爾茨海默病的作用等幾方面的關聯性進行了探討。通過TCMSP 數據庫共發現夏枯草的主要活性成分11 個，通過TCMID數據庫和相關文獻檢索得到另外8個活性成分，一共得到19個主要活性成分，這19個成分分別是：Vulgaxanthin-I、Betulinic acid、Quercetin、Morin、Stigmasterol、poriferasterol monoglucoside_qt、Spinasterol、Kaempferol、Delphinidin、stigmast-7-enol、beta-sitosterol、Luteolin、wogonin、Oleanolic acid、ursolic acid、Hesperidin、Hyperoside、Rutin、Rosmarinic Acid，這可能是夏枯草發揮藥效的主要活性物質，其中M3(Quercetin)、M8(Kaempferol)、M12(Luteolin)、M13(wogonin)、M15(ursolic acid)、M19(Rosmarinic Acid)共6種活性成分可能為抗阿爾茨海默病的關鍵化合物。檢索阿爾茨海默病的相關靶點，與夏枯草活性成分作用靶點進行PPI網絡構建，得到39個關鍵靶點。對關鍵靶點進行富集，得到夏枯草抗阿爾茨海默病的關鍵信號通路，主要包括炎癥相關白介素信號通路、細胞對應激的反應信號通路、PIP3激活AKT信號通路，推測夏枯草的活性成分可能通過作用于相關的靶點蛋白從而影響相關的信號通路而發揮抗阿爾茨海默病的藥效。從網絡藥理學角度探討并揭示夏枯草的主要活性成分、作用靶點、相關生物信號通路和阿爾茨海默病的關系，為后續進一步研究夏枯草的作用機制提供理論依據，同時也為夏枯草的進一步臨床研究開發及臨床應用提供理論依據。

人類社會老齡化已成為人類發展的一種趨勢，隨著我國老齡化速度加快，老齡化人口急劇上升，且為世界老年人口最多的國家，阿爾茨海默病(Alzheimer Disease)的發病率也隨著老齡化的進程而節節攀升。AD是一種中樞神經系統慢性退行性疾病，老年人是主要的發病人群，在65～74歲老年人中的發病率為3%，而在75～84歲的老年人中發病率上升至17%，更嚴重的是在85歲以上的老年人中發病率有32%[28]。目前在臨床上針對阿爾茨海默病使用的藥物有膽堿酯酶抑制劑類和谷氨酸受體阻斷劑兩類[29]，患者長期服用藥物后雖癡呆癥狀得到減輕，但會產生睡眠障礙、肌肉痙攣、嘔吐腹瀉、心動過慢和加重哮喘等不良反應。因此，研究并開發有效的抗AD藥物，具有非常重要的科學意義和社會價值。

關于AD的發病機制，有很多學者提出不同的假說，得到認可的主要有炎癥機制、中樞膽堿能、tau蛋白的過度磷酸化、細胞凋亡機制、β-淀粉樣蛋白、遺傳因素以及腸道菌群失調等[29-30]。在AD患者的腦內，發現β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)特異性免疫反應機制受損，從而激活腦內的小膠質細胞，釋放出炎癥介質，引起局部的炎癥反應，而局部的炎癥反應又會加劇Aβ的堆積，進而形成惡性循環[31]。

通過網絡藥理學的Metascape分析，發現夏枯草活性成分可能發揮抗阿爾茨海默病的3個關鍵信號通路，這些相關通路都已經在相關研究中進行了報道，而針對夏枯草活性成分在目前并無抗阿爾茨海默病的報道，但已有研究表明，水蓼中的beta-sitosterol能充分到達大腦，抑制參與膽堿酯酶代謝的酶，并作為自由基清除劑而發揮抗AD的作用[32]，β-sitosterol能通過雌激素受體介導PI3K / GSK3β信號結合到膜而發揮抗氧化應激和脂質過氧化作用[33]。kaempferol能通過抗炎而發揮抗AD[34]，沉香中的kaempferol有抗AD的作用[35]，銀杏中的kaempferol可以快速透過血腦屏障進入海馬細胞外液，30 min內達到最大濃度，通過抑制腦內Aβ的形成從而發揮抗阿爾茨海默病效應[36-38]。Spinasterol已經被報道參與各種生物活動，可以通過細胞外信號調節激酶(ERK)途徑來增加腦內細胞抗氧化的特性，具有抗氧化應激和神經炎癥引起的神經退行性疾病的治療潛力[39]，Stigmasterol已經被報道通過激活雌激素或NMDA受體來增強膽堿能神經傳遞系統從而發揮認知改善抗阿爾茨海默病的作用[40]。Delphinidin可以抗阿爾茨海默病主要是通過減弱細胞內鈣的內流和tau蛋白過度磷酸化，保護細胞免受Aβ誘導的神經毒性[41]。Luteolin被報道為一種ROS清除劑，對AD的學習缺陷和海馬結構具有潛在的保護作用[42]，Morin可以有效的破壞Aβ的聚集，細胞毒性小，可以改善阿爾茨海默病患者的認知能力[43]，Vulgaxanthin-I作為一種良好的過氧自由基清除劑，通過發揮抗氧化作用而對阿爾茨海默病發揮相應的藥效[44]，丹參中的提取物stigmast-7-enol具有抗氧化抗炎及抗膽堿酯酶等活性，能對阿爾茨海默病起到一定的治療作用[45]，同時黃酮類中的quercetin由于具有高氧自由基清除活性或者是抑制黃嘌呤氧化酶和脂質過氧化的能力，能可靠地增加神經元的抵抗力，抑制iNOS和調節COX-2的表達產生抗炎作用，從而發揮神經保護作用[46]。這些有效成分在夏枯草中均為夏枯草的主要有效成分，因而夏枯草可能通過抑制大腦膠質細胞活化所產生的炎癥反應以及通過PI3K通路抗腦內的氧化應激對阿爾茨海默病起到治療作用，這將為夏枯草抗阿爾茨海默病的作用及其機制研究均能有一定的啟發作用，并為夏枯草抗阿爾茨海默病作用物質基礎和作用機制研究提供一個思路。

本研究的結論依舊存在一定的局限性，由于本研究只依托數據庫，通過數據的檢索來對藥物的功效進行預測，因此，還需要進行體內體外的實驗研究來驗證。同時，僅以OB和DL作為活性化合物篩選的指標有一定的局限性，因為藥物的吸收利用不只口服這一條途徑，還可做成其他劑型應用于臨床，口服生物利用度低的成分需要得到重視，可能存在更廣泛的治療作用。本研究僅為中藥科研提供一個思路，后續還需通過系統的實驗研究進一步證實。