山奈酚腸溶復合納米粒的體外釋放和藥代動力學研究

陳劍秋，黃 潔，徐 雯，齊祥秋，杜 倩*

(1.徐州醫科大學 藥學院，江蘇 徐州 221004；2.江蘇省新藥研究與臨床藥學重點實驗室，江蘇 徐州 221004)

山奈酚(Kaempferol)是一種黃酮類化合物，主要來源于姜科植物山奈的根莖，藥理活性確切，可用于腫瘤、心血管疾病、糖尿病和帕金森病的預防和治療[1，2]。然而山奈酚為生物藥劑學分類系統(BCS)中的Ⅱ類藥物[3]，口服生物利用度低，因此，提高其生物利用度對于臨床應用具有重要意義。多項研究[4-6]表明，多層結構的復合納米粒，如殼聚糖衍生物表面修飾的脂質納米粒能夠促進難溶性藥物的口服吸收。其中脂肪酸接枝三甲基殼聚糖可作為“殼”修飾于脂質載體的表面，形成“殼-核”結構，有效提高難溶性藥物的口服吸收度[5]。本課題組的前期研究制備了癸酸接枝三甲基殼聚糖修飾的山奈酚納米結構脂質載體，粒徑為(112.3±3.3)nm，載藥量為5.45%。本文進一步采用腸溶材料(Eudragit L30D-55)對納米粒進行包覆以提高腸部吸收作用，同時考察其體外釋放行為和體內藥動學特征。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Primaide日立高效液相色譜儀(日本日立公司)；JY 92-IIN超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技公司)；RCT B S025恒溫磁力攪拌器(德國IKA集團)；MS104S/01分析天平(梅特勒-托利多公司)；AB265-S電子天平(梅特勒-托利多公司)；H1850臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；SHZ-82A數顯恒溫振蕩器(金壇區白塔新寶儀器廠)；透析袋(上海源葉生物有限公司，截留分子量：8000 Da)。

1.2 藥品與試劑

山奈酚(成都普菲德生物技術有限公司批號：18042303)；腸溶丙烯酸樹脂Eudragit L30D-55(Evonik_Rhom，pH>5.5溶解，批號：B130814318)；硬脂酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：I1516021)；單硬脂酸甘油酯(薩恩化學技術有限公司，批號：CE050024)；辛酸癸酸甘油三酯(上海源葉生物有限公司，批號：Y29M9S62440)；二乙二醇單乙基醚(山東優索化工科技有限公司，批號：S12907115)；聚氧乙烯蓖麻油EL(德國BASF，批號：D1627045)；大豆磷脂(上海艾韋特醫藥科技有限公司，批號：SY-SI-151004)；癸酸接枝三甲基殼聚糖(DT，由本課題組制備)；其余試劑均為分析純或色譜純。

1.3 實驗動物

雄性SD大鼠，體重(200±20)g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，許可證號 SCXK(魯)2014-0007。

2 方法與結果

2.1 山奈酚腸溶復合納米粒制備

稱取處方量的硬脂酸、單硬脂酸甘油酯、辛酸癸酸甘油三酯、二乙二醇單乙基醚和聚氧乙烯蓖麻油EL，水浴加熱熔融作為油相；另稱取山奈酚和大豆磷脂溶解于少量無水乙醇并與油相混勻，之后在65 ℃水浴和800 rpm磁力攪拌下，緩慢滴加適量超純水，繼續攪拌60 min形成初乳并揮去有機溶劑，最后超聲探頭分散6 min(功率：650 W，頻率：20 kHz)，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得山奈酚納米結構脂質載體(KNLC)。將適量DT溶解于超純水，緩慢加入上述KNLC納米分散液，37 ℃孵育180 min，得癸酸接枝三甲基殼聚糖修飾山奈酚納米結構脂質載體(DT-KNLC)。將稀釋至適宜濃度的Eudragit L30D-55水分散液與適量DT-KNLC混合，100 rpm磁力攪拌30 min，即得山奈酚腸溶復合納米粒(EL-DT-KNLC)。

2.2 體外釋放試驗

采用動態透析法。根據文獻，選擇35%乙醇溶液為釋放介質[7-8](分別用鹽酸和檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖鹽調節至pH=1.0和6.0)，以達到漏槽條件。分別精密量取1 mL DT-KNLC和EL-DT-KNLC分散液裝入透析袋，投入到50 mL釋放介質中，于37 ℃氣浴中恒溫振蕩(100 rpm)，分別在10 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h取樣1 mL，每次取樣后補加1 mL等溫釋放介質，取出的溶液用0.45 μm微孔濾膜濾過，HPLC測定，計算山奈酚濃度和累積釋放率，繪制體外釋放曲線。使用OriginPro 8.0軟件對體外釋放曲線進行一級、Higuchi、Ritger-Peppas和Weibull方程擬合。由圖1可知，EL-DT-KNLC在pH=1.0的介質中0～4 h幾乎無釋放，而在pH=6.0介質中，0～4 h累積釋放量可達28.77%，DT-KNLC在pH=1.0和6.0的兩種介質中的釋放曲線接近。結果表明EL-DT-KNLC能極大地減少山奈酚在胃酸環境下的釋放，達到腸溶效果。曲線擬合結果見表1，從回歸系數可以判斷，pH=6.0的介質中EL-DT-KNLC的釋放曲線與Higuchi方程相關性最好，且Ritger-Peppas方程擬合結果n>0.89，表明山奈酚的釋放機制為擴散與溶蝕作用相結合。

圖1EL-DT-KNLC和DT-KNLC的體外釋放曲線

表1EL-DT-KNLC體外釋藥擬合方程

2.3 大鼠口服藥代動力學

2.3.1 給藥方案與樣品采集 將6只雄性SD大鼠隨機分為DT-KNLC和EL-DT-KNLC組，每組3只。所有大鼠禁食12 h，不禁水，口服灌胃給藥，給藥劑量為16 mg/kg。給藥后于10 min、20 min、1 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h和72 h從大鼠眼眶靜脈叢取血，全血置于1.5 mL肝素化EP管中，6 000 rpm離心10 min，分離出血漿，置于-20 ℃保存備測。

2.3.2 血漿樣品處理 精密吸取血漿樣品100 μL，依次加入100 μL鹽酸(2 mol/L)和10 μL抗壞血酸溶液(5%，w/v)，80 ℃水浴加熱30 min。待冷卻至室溫，加入300 μL乙酸乙酯，渦旋3 min，10 000 rpm離心10 min，吸取全部上層有機相，再加入100 μL乙酸乙酯重復上述步驟。將乙酸乙酯在40 ℃下真空濃縮揮干，殘留物中加入100 μL甲醇超聲復溶，12 000 rpm離心10 min，取上清液至棕色進樣小瓶中，進HPLC測定。

2.3.3 色譜條件 色譜柱：Wondasil C18-WR(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.05%三氟乙酸水溶液(65∶35)；流速：1 mL/min；檢測波長：360 nm；進樣體積：5 μL；柱溫：35 ℃。在上述色譜條件下，大鼠血漿樣品中山奈酚的峰形良好，在出峰處無雜質干擾，專屬性結果見圖2。

(A：山奈酚標準溶液；B：給藥后的血漿樣品；C：空白血漿)

2.3.4 方法學考察 精密吸取100 μL大鼠空白血漿6份，加入山奈酚對照品貯備液，配制山奈酚濃度分別為22.32、7.44、1.86、0.89、0.60、0.15 μg/mL的質控樣品，按血漿樣品處理方法操作，進HPLC依次分析，記錄峰面積。分別以峰面積(X)為橫坐標，濃度(Y)為縱坐標，進行線性回歸運算。結果表明，山奈酚在0.149～22.32 μg/mL濃度范圍內與其峰面積積分線性關系良好，回歸方程為Y=8.07(10-5X+ 0.10，r=0.999 9。濃度為0.83、2.58、22.32 μg/mL的山奈酚質控樣品的提取回收率分別為85.74%、95.78%、92.68%；日內精密度分別為2.12%、0.74%、1.62%；日間精密度分別為3.91%、0.54%、1.11%；24 h放置(室溫)以及反復凍融3次條件下樣品濃度的RSD值均小于5%，符合生物樣品定量分析的要求。

2.3.5 測定結果 使用DAS 2.0(BioGuider Co.，Shanghai，China)軟件擬合藥時曲線并計算藥動學參數，大鼠血漿中山奈酚的血藥濃度-時間曲線見圖3，主要藥動學參數見表2。從結果可以看出，EL-DT-KNLC的藥時曲線更加平緩，其達峰時間Tmax是DT-KNLC的1.57倍，平均駐留時間是DT-KNLC的1.15倍，差異均具有統計學意義(P<0.05)，結果提示腸溶丙烯酸樹脂的包覆推遲了藥物的達峰并延長了其在大鼠體內的停留時間。

圖3山奈酚藥-時曲線

表2 山奈酚主要藥動學參數

注：與DT-KNLC組比較，*P<0.05。

3 討論

殼聚糖及其衍生物能夠可逆地打開腸道上皮細胞的緊密連接，并且能依靠其良好的生物黏附性與之緊密結合，增加藥物的接觸時間，減少藥物清除，提高生物利用度，因此可作為脂質載體的外部修飾材料[9]。在此基礎上，本文進一步嘗試將帶有負電荷的Eudragit L30D-55腸溶丙烯酸樹脂通過靜電吸附作用包覆于DT-KNLC的表面，使納米顆粒獲得腸溶特性。為了準確檢測大鼠血漿中山奈酚的質量濃度，本研究建立了血漿樣品中山奈酚的含量測定方法。據文獻[10]報道，山奈酚口服給藥后，會在大鼠的肝臟部位發生代謝，與葡萄糖醛酸結合，吸收入血后的山奈酚主要以該結合物的形式存在，因此本研究采用鹽酸酸化加熱[11]的方式使山奈酚與葡萄糖醛酸解離，并同時加入了抗壞血酸避免藥物在加熱過程中氧化，最后采用乙酸乙酯進行萃取，最終獲得了85%以上的藥物提取回收率。

最后，本研究以上述測定方法為手段，比較了EL-DT-KNLC與DT-KNLC在大鼠體內的藥動學特征。結果顯示，EL-DT-KNLC的藥-時曲線發生了明顯變化，Tmax和MRT0-t均有顯著增加(P<0.05)，表明本文制備的山奈酚腸溶復合納米粒具有小腸定位釋放性能，并能夠明顯延長山奈酚在大鼠體內的滯留時間，具有緩釋作用。