牛傳染性鼻氣管炎診斷方法研究進展

楊飛，宋志峰，劉丹，黃小潔，侯力丹，郎洪武*

(1.中國獸醫藥品監察所，北京 100081；2.東北農業大學，哈爾濱 150000)

牛傳染性鼻氣管炎(infectious bovine rhinotracheitis，IBR)在臨床上主要以呼吸困難、氣管黏膜發炎等呼吸道癥狀為特征，又因會同時引起膿皰性外陰陰道炎，故又稱為傳染性膿皰性外陰陰道炎，還可引起公牛龜頭炎、母牛流產、結膜炎、幼牛腦膜腦炎等，被認為是可由同一種病原引起的多種病癥的疫病[1]。牛傳染性鼻氣管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)又名牛皰疹病毒1型(bovine herpesvirus 1，BHV-1)，屬于皰疹病毒科水痘病毒屬，有4個亞型和一個血清型。IBRV感染牛后可在三叉神經形成潛伏感染和持續性感染，病牛終生帶毒。在應激條件下，該病毒可被激活使機體排毒而引起該病在牛群中的傳播流行，這也為消滅和根除該病埋下了隱患，增加了困難。

20世紀50年代，以傳染性鼻氣管炎癥狀為特征的疾病最先見于美國科羅拉多州的育肥牛群，后因貿易交易使得IBRV廣泛流行于歐洲[2]。該病在全世界流行，目前只有少數歐洲國家采取消滅撲殺、禁止疫苗接種等方式根除了該病，如瑞士、奧地利、芬蘭等，其他國家均有該病的報道[3]。2002年至2009年的血清調查報告結果表明，歐洲牛群中IBR血清陽性率為50%～90%，比2000年的調查結果有明顯提高。2013年，巴西發現一例IBR病例。2015年，澳大利亞出口的活牛IBR血清陽性率已高達39%。在我國，IBR屬于外來病，首次被發現是在1980年，周泰沖等從新西蘭進口奶牛中分離得到，此后該病在我國的流行趨勢也是不斷上升。2007年，gE-ELISA方法檢測奶牛血清的數據結果顯示，我國IBR血清學個體陽性率為35.8%[4]。2016年有文獻報道我國上海崇明島地區兩個規模化奶牛場的IBRV抗體陽性率分別為41.2%和74.3%，新疆五個規模化牧場 IBR 血清學檢測陽性率為 80.7%，寧夏地區IBRV抗體檢測平均陽性率高達85.1%[5-7]。這些數據表明了IBR在我國牛群中感染的普遍性和嚴重性。但我國是養牛大國，根除IBR耗資巨大，對于發展中國家很不適用，所以為有效控制IBRV的擴散傳播，建立有效的診斷方法以及時監測和預防IBR才是關鍵。本文綜述了IBRV的最新國內外檢測方法研究進展，以期為檢測和防控IBR提供參考。

1 病原學診斷

1.1 病毒的分離鑒定 IBRV可在多種原代或傳代細胞中生長，如牛胎腎、腎上腺、甲狀腺、睪丸、鼻甲骨等細胞中生長，目前普遍使用的是牛腎傳代細胞(MDBK)和牛氣管傳代細胞(BTC)。一般根據病牛的臨床癥狀，選擇不同的部位進行病料的采集，呼吸道型病牛主要采集鼻液或眼分泌物；眼結膜型病牛主要采集眼分泌物；腦膜腦炎型病牛主要采集腦組織；生殖道型母牛主要采集外陰陰道分泌物和外陰部黏膜，公牛主要采集精液和包皮；流產型病牛可采集肺臟、肝臟、腎臟等實質性器官或胸腔積液。IBRV首次分離不易出現典型的病變(CPE)，需要盲傳2～3代后再進行觀察。將采集的病料處理后接種到適宜的細胞上，細胞病變一般在3～5 d。典型的CPE為細胞圓縮、聚集成葡萄樣的細胞團，細胞團之間形成空洞以及多核巨大細胞的產生。若要進一步鑒定是否為IBRV感染，可用IBRV單克隆抗體或者抗血清進行中和試驗，或間接免疫熒光試驗。孔繁德等[8]將采集的鼻拭子和血清混合震蕩后離心，其上清液接種于單層的MDBK細胞，盲傳3代后出現典型CPE，IBR陽性血清作用于該單層細胞后，CPE被明顯抑制。冷雪等[9]采集內蒙古發病牛的鼻拭子液并經過MDBK細胞傳代培養以及PCR、間接免疫熒光試驗和動物回歸試驗分離鑒定出一株IBRV。病毒分離鑒定方法雖然可靠，但整個過程比較復雜，費時費力，效率不高，所以在臨床上不推薦使用。

1.2 病毒核酸檢測

1.2.1 聚合酶鏈式反應(PCR) 1985年，Mullis等[10]向全世界推廣PCR方法以后，由于該技術快速、特異、敏感、費時少的優點，已廣泛應用于分子生物學領域，可用于檢測血清、組織、鼻拭子、精液中的病毒。研究者針對IBRV基因組編碼蛋白的不同，設計特異性引物，建立PCR方法，用于檢測IBRV。林梅等[11]根據IBRV TK基因設計引物，建立了可鑒別TK基因缺失株與野毒株的PCR方法。徐娜等[12]根據GenBank中IBRV gE和gB基因序列，設計了2對特異性引物，建立了特異性強、準確、快速的PCR方法。同時還可根據病原種類的不同，建立同時檢測多種病原的多重PCR方法，可達到更高效、簡便的目的。范晴等[13]建立了同時檢測牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、牛支原體和IBRV的三重二溫式PCR方法，為這3種病原的診斷提供了一種方便使用的方法。楊帆等[14]建立了同時檢測牛副流感病毒3型、IBRV、BVDV和牛支原體多重PCR檢測方法，可鑒別診斷4種病原，具有特異性強，靈敏度高的特點。PCR是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，能將微量的DNA以指數方式增加，且對模板提取物純度要求低，能達到靈敏度高、簡便、快速的要求，但是該方法易出現假陽性、假陰性的結果，也有一定的缺陷。

1.2.2 熒光定量PCR(qPCR) 熒光定量PCR 是通過熒光染料或熒光標記的特異性探針，標記跟蹤PCR產物進行實時監測反應，利用與之相適應的軟件對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。該方法已廣泛應用于分子生物學、醫學、食品檢測和環境監測等多個領域，且與普通PCR相比，具有更高的特異性和敏感性。目前實驗室常用的熒光化學方法有兩種，分別是DNA結合染料(SYBR Green I)和標記上熒光染料的特異性寡核苷酸探針(TaqMan探針、雜交探針)。季新成等[15]根據BHV-1 gB基因序列，設計高度保守的引物和熒光探針，建立了含有內標物的熒光定量PCR檢測體系，靈敏度比常規PCR和病毒分離高出10～100倍，與不加內標的熒光PCR檢測靈敏度相當，且內標模板可監測、指示并校正假陰性結果,從而提高PCR檢測準確率。該方法的建立可實現臨床樣品中BHV-1的快速檢測，加強實驗室的質量控制。謝志勤等[16]根據IBRV gB基因序列和BVDV 5′端非編碼區序列的保守區域,分別設計1對IBRV的特異性引物和1條FAM標記的TaqMan探針，1對BVDV的特異性引物和1條ROX標記的TaqMan探針,建立了雙重熒光定量PCR方法，適用于臨床樣品的鑒別檢測。宋爽等[17]根據高度保守的BVDV的5’UTR基因、IBRV的gB基因和口蹄疫病毒(FMDV)的3D基因,分別設計了3對對應的特異性引物和3種不同發光基團標記的TaqMan探針，建立了同時檢測這3種病毒的多重熒光定量PCR方法，可同時快速鑒別檢測BVDV、IBRV和FMDV。張穎慧等[18]首次建立了檢測IBRV核酸的恒溫隔絕式PCR(iiPCR)方法，該方法配合PetNAD核酸萃取試劑盒，從核酸提取到報告檢測結果僅需1 h，具有操作簡便、快速、可現地化的特點。Shubhada K Chothe等[19]開發了一種新型的基于核苷酸多態性(SNP)的PCR檢測方法，通過illumina Miseq平臺對來自賓夕法尼亞州和明尼蘇達州的18株BHV-1分離株和5株BHV-1疫苗株進行全基因組測序，基于SNP可將序列分為兩個不同的疫苗株組和一個野毒株組。該方法可以區分疫苗株和野生型毒株，幫助準確確定BHV-1的發病率以及疫苗接種與牛臨床發病的關系。

1.2.3 等溫擴增技術 環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)，能在等溫(60～65 ℃)條件下，短時間(通常是1 h內)內進行核酸擴增，是一種簡便、快速、精確、低價的基因擴增方法。與常規PCR方法相比，該方法不需要模板的熱變性、溫度循環、電泳及紫外觀察等過程，是一種全新的核酸擴增方法，可不依賴任何專門的儀器設備實現現場高通量快速檢測，檢測成本遠低于熒光定量PCR，也為IBRV的快速檢測提供了新的技術。郭利等[20-21]從NCBI數據庫中獲得的IBRV的保守gE序列，分別建立了LAMP可視化檢測方法和應用金納米顆粒與PCR結合的納米PCR(nano-PCR)新型檢測方法。LAMP方法可檢測到2.23×103copies/μL的BHV-1基因含量，其臨床樣品的陽性檢出率高于普通PCR。Nano-PCR方法的敏感性是LAMP和普通PCR方法的10倍，其敏感性和特異性更適合于臨床樣品的檢測，且可與 LAMP 配合使用，為IBR 的篩查和治療預防提供了技術支撐。高峰等[22]根據 GenBank 中發表的 IBRV 全基因序列，利用 MEGA 3.1 進行同源性比對，選擇基因中的高度保守區域設計了LAMP引物，建立了可視化IBRV LAMP檢測方法，適用于口岸進出口動物的 IBR 快速檢疫。董世娟等[23]根據IBRV gB基因保守序列設計了3對LAMP引物建立了IBRV可視化LAMP方法，該方法可以檢測到10 copies/μL的質粒 DNA，與 nested-PCR 方法的敏感性相當，比 PCR 方法敏感1000倍，適合基層和現場對臨床樣本進行快速檢測。聚合酶螺旋反應(PSR)是等溫技術領域的新成員，Malla J A等[24]已成功建立了PSR方法，用于檢測流產的牛胎兒組織和牛精液中的BHV-1。該方法比傳統PCR靈敏100倍，與實時PCR相當，可在冷凍精液站和奶牛群中快速、準確、靈敏地檢測BHV-1。

1.2.4 基因芯片技術 隨著人類基因組計劃的逐步實施以及分子生物學相關學科的迅猛發展，越來越多的動植物、微生物基因組序列得以測定，一種新型、高效、快速檢測和分析遺傳信息的雜交和測序方法得以建立，即基因芯片技術。季新成[25]將標有熒光染料的 PCR產物變性后與芯片上寡核苷酸探針雜交，對IBRV重組DNA 的檢測靈敏度均為 103copies/μL；同時還建立了IBRV、BVDV和犬新孢子蟲3種病原的懸浮液態芯片檢測技術，對IBRV的檢測靈敏度為103copies/μL，具有較好的特異性和可重復性。陳圣軍等[26]根據 IBRV gB 基因和赤羽病病毒 S 基因序列設計合成了 2 對特異引物和探針，建立了同時快速檢測這兩種病毒的基因芯片檢測方法。魏春霞等[27]建立了牛布魯氏菌病、結核、炭疽、FMD、BVD、副流感、IBR可視化基因芯片檢測方法，根據已公布的各病原核酸序列，設計了引物和探針，并將PCR產物與探針特異性雜交，從而實現了一次試驗即可對7種病原的同時快速檢測。該基因芯片檢測方法單一病原靈敏度檢測可達1.0×10-6ng/μL,混合病原靈敏度檢測可達1.4×10-5ng/μL，具有高通量、高靈敏度、高特異性等特點。

2 血清學診斷

2.1 酶聯免疫吸附試驗(ELISA) ELISA方法已被廣泛應用于多種細菌和病毒等疾病的診斷。在動物檢疫方面，ELISA在豬傳染性胃腸炎、牛副結核病、牛傳染性鼻氣管炎、豬偽狂犬病、藍舌病等的診斷中已為廣泛采用的標準方法，也是OIE指定的檢測IBRV的方法之一。該方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體 (聚苯乙烯微量反應板) 表面，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除，具有靈敏、快速、特異、操作簡單等優點。常用的 ELISA 法有雙抗體夾心法和間接法，目前在市場上占據主導地位的是間接ELISA試劑盒。IBRV的gB、gC、gD、gE和gG為其主要的免疫原性蛋白，這些蛋白已先后被學者研究作為IBRV檢測的靶蛋白用于建立ELISA方法。曹翀等[28]建立了IBRV gB蛋白為檢測抗原的間接ELISA方法。Bertolotti等[29]建立了檢測IBRV gE抗體的間接ELISA方法。馬輝[30]、周躍輝[31]等分別制備了gC和gD的單克隆抗體，建立了雙抗體夾心ELISA方法。向文杰[32]制備了IBRV VP8蛋白單克隆抗體并以全病毒為抗原制備了阻斷ELISA方法。張帆[33]對我國IBR的流行情況做了Meta分析并建立了gE間接ELISA方法，可用于奶牛場中IBR的流行病學調查。Barbara Colitti等[34]利用IBRV gE間接ELISA方法檢測混合牛奶樣品中的IgG濃度，該方法顯現出了非常好的診斷性能，且降低了檢測成本，可用于控制游離和接種標記的奶牛群中的IBR。

2.2 中和試驗(VN) 中和試驗是最標準、最經典的血清抗體檢測方法，也是OIE指定的試驗檢測方法之一。由于IBRV只有一個血清型，只要用標準毒株的免疫血清在細胞培養后進行中和試驗就可鑒定，但受病毒效價、血清與病毒的孵育時間長短等因素的影響，使得該方法具有耗時費力結果易受外界因素影響等缺點。因為IBRV可以潛伏感染，所以，即使牛群血清抗體檢測為陰性，仍不能保證牛無病毒感染[35]。

2.3 間接血凝試驗(IHA) 間接血凝試驗是一種簡單易行的血清抗體檢測方法，可用常規的試管凝集法和微量凝集法進行。但IHA易受諸多因素影響，出現假陽性的結果。陳天祥[36]、楊春明[37]等分別建立了IBRV的IHA方法，結果較好。

2.4 間接免疫熒光試驗(IFA) IFA主要用于檢測抗原，是一種操作簡便、快速、特異性高的檢測方法。該方法中可用BALB/c小鼠制備的IBRV單克隆抗體為一抗，加到接種IBRV的細胞培養物中，以FITC(異硫氰熒光素)標記的抗鼠免疫球蛋白為二抗，置熒光顯微鏡下觀察熒光結果即可。IBRV單克隆抗體的高特異性使得IFA方法可不局限于只用IBR陽性血清作為一抗才能檢測出抗原，更加豐富了該方法的內容。

2.5 瓊脂擴散試驗(AGP) AGP既可用于檢測抗原，也可檢測抗體，操作簡便，但敏感性較低，只有感染牛抗體呈現出很高的滴度時才能被檢出，應用價值不高。

2.6 膠體金檢測技術 膠體金檢測方法也是一種快速簡單的檢測抗原或抗體的方法。王武軍等[38]建立了斑點免疫金滲濾法(DIGFA)檢測IBRV抗體，僅需5 min即可判定結果。梅力等[39]用膠體金將sf9昆蟲細胞-桿狀病毒系統重組表達的IBRV-gD蛋白標記作為示蹤抗原，未標記的gD蛋白作為捕獲抗原，以羊抗牛IgG抗體作為質控抗體，建立了IBRV雙抗原夾心法膠體金檢測試紙條，該試紙條與IDEXX的IBRV抗體ELISA檢測試劑盒的陽性符合率為93.5%，陰性符合率為96%，可用于臨床IBRV抗體的檢測和診斷。

3 結 語

IBR在我國區域內分布不均，且在奶牛中陽性率呈上升趨勢，說明近年來我國IBRV在奶牛群中感染越來越嚴重。我國是養牛大國，養牛業正向集約化、規模化發展迅速，且進出口奶牛數量巨大，貿易頻繁，這更加速了IBR的流行與傳播，給我國養牛業帶來了巨大損失。歐洲幾個國家采取了根除IBR的計劃，也取得了顯著成效，但綜合考慮各種因素，根除計劃并不適用于我國。國內商品化的IBR疫苗近兩年才獲得新獸藥證書并上市，為牛病毒性腹瀉/黏膜病、牛傳染性鼻氣管炎二聯滅活疫苗，這為國內IBR疫苗的研發打下了基礎，同時也說明加強病原檢測技術和方法研究對預防和控制該病的重要性。

綜上所述，檢測IBRV的方法各種各樣，但是每種方法都有其優缺點和實用性，qPCR方法、LAMP方法和基因芯片技術相較于PCR方法，敏感性高、特異性強、高效、不易出現假陰性結果，且LAMP方法和基因芯片技術是近期出現的較為先進和有代表性的新型檢測方法，操作簡便，臨床上可達到高通量、快速檢測的目的。血清學檢測中ELISA方法為OIE指定的檢測IBRV的方法之一，且在國外也有商品化的試劑盒應用，而間接免疫熒光方法雖然需要病毒接種細胞后才能進行，但該方法相較于ELISA方法特異性強，敏感性高，不會出現假陽性，這兩種方法均成本低，可實現大批量檢測。但在實際情況下還應因地制宜，具體情況具體分析。膠體金檢測技術和LAMP方法特別適合于廣大基層檢驗人員以及大批量檢測和大面積普查等, 其結果快速且肉眼可見，具有巨大的發展潛力和廣闊的應用前景。而qPCR、ELISA、間接免疫熒光和中和試驗等需要在實驗室條件下進行，中和試驗結果雖然易受多種因素影響，耗時費力，但卻是最標準、最經典的血清抗體檢測方法，也是OIE指定的試驗檢測方法之一。以上方法均可推薦使用，并且隨著分子生物學技術的不斷發展與革新，IBRV的檢測方法會越來越具有高效、敏感、快速、特異的特點，能在IBR的控制和根除中起到重要作用，同時我國也應該制定更嚴格的進口檢疫政策，及時實施免疫預防措施，并加強飼養管理，控制環境衛生，從而使養牛業向著更加健康的方向發展。