貓冠狀病毒分子進化、免疫病理機制和疫苗研究進展

劉玉秀 ， 黃柏成 ， 田克恭

(國家獸用藥品工程技術研究中心 ， 河南 洛陽 471000)

貓冠狀病毒(Feline coronavirus，FCoV)具有2種血清型(I型和II型)，又分為2種生物型或病理型，一種是貓腸道冠狀病毒(Feline enteric coronavirus，FECV)，主要引起輕度到重度腸炎；另一種是貓傳染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus，FIPV)，主要引起感染貓腹膜炎、眼膜炎及神經癥狀等。FIPV被認為是FECV缺失突變體，其在貓群中不存在水平傳播，具有抗體依賴性增強特性，接種疫苗后高水平的抗體反應會加快傳染性腹膜炎(Feline infectious peritonitis，FIP)的發展。本文對貓冠狀病毒的分子生物學、FECV/FIPV突變的組織嗜性改變機制、FIPV感染的病理學成因及免疫效力評估進行了總結，以期為國內貓冠狀病毒的防控提供科學依據。

1 貓冠狀病毒基因組

貓冠狀病毒(FCoV)是冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒亞科(Coronavirinae)α冠狀病毒屬(Alphacoronavirus)成員，是家貓和野生貓科動物主要傳染性病原之一。根據不同的臨床表現形式，FCoV通常被認為具有2種生物型或病理型，一種是在大多數健康貓群中普遍存在的貓腸道冠狀病毒，可引起輕度到重度腸炎；另一種是貓傳染性腹膜炎病毒，以導致感染貓全身系統性、強致病力的傳染性腹膜炎為特征，亦可引起感染貓腸炎、輕度至嚴重眼疾及神經系統疾病[1]。

FCoV基因組約29 kb，11個開放性閱讀框(ORFs)，編碼4種結構蛋白：棘突(S)蛋白、包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和核衣殼(N)蛋白，7種非結構蛋白3a、3b、3c、7a、7b及復制酶1a和1b[2]。病毒螺旋核衣殼由N蛋白包裹多個RNA拷貝而組成，N蛋白主要保護病毒基因組，可誘導機體產生細胞免疫[1]。M蛋白是病毒含量最豐富的糖蛋白,其通過3個跨膜結構域隨機分布在病毒包膜上。E蛋白是插入病毒包膜中的III型膜蛋白，含量遠小于M蛋白和S蛋白，其缺失不影響病毒復制，但會減弱病毒毒力[3]。S蛋白屬于I型病毒融合蛋白，是病毒進入宿主細胞的主要調節因子。FCoV的16個非結構蛋白由1ab，3abc和7ab基因編碼，1ab編碼的復制酶復合物參與轉錄，生成用于轉錄結構蛋白和輔助蛋白的模板[4]。3abc輔助蛋白中的3c與FCoV毒力和組織嗜性變化有關[1]。7ab參與FCoV感染的免疫反應，7a蛋白是一種I型干擾素拮抗劑，7b蛋白可誘導自然感染貓的抗體反應[5]。

2 貓冠狀病毒血清型

FCoV根據S蛋白氨基酸序列和抗體交叉中和差異分為2種血清型：I型和II型[6]。血清I型是主要流行毒株類型，其S蛋白完全來源于FCoV[1]。血清II型FCoV臨床不常見，由犬冠狀病毒(Canine coronavirus，CCoV)和FCoV雙重重組而來。生物信息學分析和抗體中和試驗表明，血清II型FCoV和CCoV的S蛋白序列間相似度高[6]，79-1146株S基因與CCoV及豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)S基因相似率(分別為91%和81%)顯著高于血清I型FCoV(46%)[7-8]。多數體外分離和培養的FCoV毒株為血清II型，而臨床流行更廣的血清I型FCoV難以分離，嚴重阻礙了對FCoV的體外研究。

3 貓冠狀病毒生物型

血清I型和II型FCoV毒株均存在2種在抗原和形態學上不同的生物型(或病理型)：FECV和FIPV。FECV在野貓中感染率可達90%[9]，一般無癥狀或輕微腸炎癥狀，而FIPV則致病性極高，引起感染貓致死性傳染性腹膜炎。研究認為，FIPV是感染貓體內FECV突變產生的一種變異生物型[10-11]。2種生物型的組織嗜性和生物特性存在較大差異，FECV經糞口途徑在貓群中傳播，而FIPV與感染動物細胞和組織緊密結合，極少情況下才有可能在糞便或尿液中排毒，不具有水平傳播能力。這種機制類似于貓白血病病毒(Feline leukemia virus，FeLV)感染貓后突變為貓肉瘤病毒(Feline sarcoma virus,FeSV)，FeSV在自然界中不能水平傳播，但FeLV可在貓的各種排泄物和分泌物中排出并可水平傳播[12]。

病毒嗜性的變化是病毒與宿主細胞相互作用的結果，宿主細胞中受體、共受體、生化條件(如蛋白酶、離子、pH)的存在或缺失都可能是這些變化的決定因素。突變理論表明，無癥狀的FECV感染貓暴露于反復的“感染-康復-再感染”循環中，體內FECV突變將致使病毒毒力和組織嗜性擴大而成為FIPV，但失去病毒傳播特性[1,13]。S、3abc和7ab基因被證實存在這種突變[14-17]。S基因的突變可能是FECV突變為FIPV的關鍵，特別是編碼S1/S2裂解位點區域。FECV具有一個可能被類糠蛋白酶裂解的S1/S2序列，而FIPV具有一個可被其他蛋白酶激活的S1/S2突變序列，這表明FCoV生物型轉變需要S蛋白酶激活[14]。位于S蛋白融合肽區域的突變也被認為與FECV/FIPV特異性突變有關。Chang等發現S2蛋白存在的M1058L突變幾乎可完全區分(>95%)來自健康貓和病貓中的FECV和FIPV序列[15]。Porter等后期也發現，M1058L突變與腸道或全身性FCoV感染一致性[16]，77%的FIP貓和100%的非FIP貓糞便樣品中FCoV S2蛋白1 058位點為Met，而91%的FIP貓和89%的非FIP貓組織樣本中此位點為Leu，但僅由S蛋白的突變不能完全將FIP從FCoV陽性樣本中區分出來。3abc和7ab的ORFs突變也與FCoV生物型轉換有關，多項研究認為3c基因的截短是FECV突變成FIPV的決定因素[1,17]，3c基因的截短或缺失常與FIPV生物型相關，而完整或非截短的3c基因與FECV相關[17]。在病貓組織中檢測到的FCoV總存在1個或突變或截短或缺失的3c基因，疑為FIPV，而健康貓體內的FCoV具有完整的3c基因[1]。3c基因功能的喪失并不能阻止病毒體內或體外復制，但可通過增強巨噬細胞內FIPV的內化和復制來顯著改變細胞趨向性。相反，親本FECV更傾向于感染腸道成熟的頂端上皮細胞。

4 發病機制

FCoV感染潛伏期可從幾周至幾年不等，感染初期具有輕微的上呼吸道或腸道癥狀，但許多貓在感染FCoV后無任何臨床癥狀[1]；FECV感染1周內就可通過糞便排出，可持續4～6個月，或在6～8個月內被清除，或可持續排毒18個月[18]。高抗體滴度(1∶100)的貓比低抗體滴度(1∶25)的貓可能更易排FECV[18]。

FIPV感染細胞至少需要2種細胞受體，第1種是細胞膜上的氨基肽酶N(Aminopeptidase N，APN)，其具有S蛋白表位特異性，貓APN是血清I型FIPV受體，但不一定是血清II型FIPV的受體[19]。有趣的是，豬和人APN不能作為FIPV受體，但兩者的嵌合體能作為FIPV的受體[20]。第2種是巨噬細胞上的Fc受體。FECV一旦突變為FIPV，就獲得識別巨噬細胞Fc受體和在巨噬細胞中大量復制的能力。巨噬細胞上的Fc受體能夠結合病毒抗體復合物，促使FIPV感染的巨噬細胞進入淋巴結區域進行病毒大量復制，由此產生的病毒血癥可使攜帶病毒的巨噬細胞沉積在血管內皮細胞中[21]，之后巨噬細胞附著并通過靜脈壁遷移，引起血管周圍的局部反應造成膿性肉芽腫，從而形成組織內FIP基本病變。

貓免疫系統有幾種機制來控制早期FIPV感染。抗體在體外可以中和FIPV，但在體內似乎有助于FIP的發生，可能由2種原因造成：首先，抗體結合病毒可能阻斷APN受體，阻止病毒與細胞的粘附，但通過補體結合(Fc)受體增強了巨噬細胞對病毒的吸附，這種抗體依賴增強(Antibody-dependent enhancement，ADE)效應對貓抗體和巨噬細胞具有特異性，并且可能涉及病毒S和M蛋白的抗體[21]；其次，病毒抗原可能不會排列在受感染巨噬細胞表面，從而限制中和抗體與病毒結合。感染抗體階段以一種迅速蔓延的以漿膜/網膜為中心的炎癥為標志，這種反應集中在小靜脈周圍，可造成膿性肉芽腫病變，周圍有大量富含蛋白質的水腫液和少量淋巴細胞、中性粒細胞和漿細胞,這個反應稱為阿爾薩斯型超靈敏反應[22]。

FIP具有滲出性(濕性)和非滲出性(干性)2種臨床形式，主要由細胞介導及受感染巨噬細胞對病毒反應方式的改變造成。如果細胞免疫在感染早期產生并足夠強可抑制病毒復制，就不會出現FIP臨床癥狀；如果感染過程僅發生體液免疫且細胞免疫激活失敗，則會導致滲出性FIP。也可能出現體液免疫和細胞免疫都很強，病毒被控制的程度遠大于滲出性疾病發展，但又未完全消除則會引起病毒復制和消除之間的拉鋸戰，導致非滲出性FIP，后者以更典型的肉芽腫為特征。無論哪種感染表現的FIP都會導致致命性免疫介導的血管炎，從發病到死亡的時間因兩種形式而異。滲出型病例常在發病2個月內死亡，具體臨床癥狀取決于受血管炎影響的臟器系統；非滲出型病例貓常有眼部癥狀，25%病例出現進行性神經癥狀，眼部和神經癥狀由這些組織中肉芽形成引起的慢性病程[18]。

5 貓冠狀病毒感染疫苗接種的風險與效益評價

幼貓在6周齡前因母源抗體保護，免受FCoV感染，此后90%貓暴露于FCoV后會發生血清抗體轉陽，一旦出現FIP，暫無有效治療藥物，死亡率100%。FIP潛伏期幾周至幾年不等，這種巨大差異給防疫工作帶來嚴峻挑戰。1991年輝瑞制藥有限公司開發的Primucell FIP減毒活疫苗，可局部刺激IgA和中和抗體產生[23]。

研究發現，FIP減毒活疫苗、滅活疫苗和亞單位疫苗免疫貓后均可觀察到ADE[23-24]，使FIP潛伏期縮短至1～2 d，病程更短，死亡更快。FIP疫苗在瑞士2個 高危貓群臨床應用顯示[25]，貓在疫苗接種后1個 月內出現FIP，接種安慰劑貓則沒有出現FIP。雖然不能確定單個病例的FIP是否由ADE引起，但FIP疫苗的免疫帶來的益處卻遠低于預期。在FIP流行地區，與接種安慰劑對照組相比，FIP疫苗免疫的貓發病率沒有任何下降。在12個不同區域進行為期6個月的疫苗田間試驗中，349只貓2次免疫Primucell FIP疫苗后有3例FIP發生(0.86%)，352只 貓免疫安慰劑疫苗有4例發生(1.1%)[26]。瑞士雙盲安慰劑田間試驗，138只16周齡純種貓在接種后15～21個月內，疫苗接種組有7例FIP死亡，安慰劑組有5例死亡[27]。在地方性流行地區，幼貓多在6～7周 齡感染，遠早于疫苗推薦的首免時間(16周齡)， 高危寵物貓群中疫苗保護效力有限甚至沒有效力，如田間試驗顯示，免疫后12個月，免疫組13/31 死亡，對照組17/34死亡[25]。另一項研究顯示，在免疫后150 d內免疫組死于FIP為12只，安慰劑組為10只，免疫后250 d內，2組死于FIP數量相當，均為13只[27]。在臨床應用中，Primucell FIP疫苗在免后8～12個月，均未能有效降低高危貓群FIP發病率。

Primucell FIP疫苗免疫保護效果取決于免疫貓暴露于FIPV的劑量[23,28]，當免疫貓暴露于低劑量強毒(<10 貓感染劑量)可見部分保護，當暴露于超過10個感染劑量(104TCID50)時，疫苗則不能保護。當感染較高劑量強毒時，多數免疫貓比未免疫貓更容易感染，表現更急性更嚴重疾病。

6 展望

FCoV的感染致病機制因病原特殊性而變得越發獨特復雜。APN特定區域的細微差異可以從根本上改變物種，甚至血清型趨向性。FECV巨噬細胞趨化性的獲得似乎是其向FIPV轉化的一個重要步驟，即從一種非致病性和局限性的腸細胞病原體向一種高毒性和全身性的單核細胞/巨噬細胞病原體轉化。

FECV及其轉化的FIPV基因型毒株中存在由不同程度的單核苷酸多態性和插入/缺失現象。同一地區貓群中分離株間基因差異很少能超過12%，但是不同地區貓群中冠狀病毒差異可達20%以上，這給疫情防控帶來極大挑戰。

FIP疫苗免疫的益處比想象的少。第一，免疫組和對照組免疫保護率沒有明顯區別；第二，免疫后由于ADE導致免疫組免后1個月死亡數高于未免疫組；第三，許多幼貓一般在6～7周感染FCoV，遠早于疫苗推薦首免時間。針對FIP的疫苗研發還需要更多的探索，如對最佳接種日齡的優化和克服ADE特性等。