梔子油對(duì)對(duì)乙酰氨基酚致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用

張俊逸，羅光明,2，柴華文，劉培培，朱梓豪

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，南昌 330004； 2.江西中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源與民族藥研究中心,南昌 330004)

對(duì)乙酰氨基酚是一種治療普通及流行性感冒的乙酰苯胺類(lèi)解熱鎮(zhèn)痛藥，因其對(duì)發(fā)熱疼痛療效好且副作用小而被廣泛用于臨床，短期低劑量使用不會(huì)對(duì)肝臟代謝造成影響，但大劑量服用對(duì)乙酰氨基酚或多種含對(duì)乙酰氨基酚的藥物聯(lián)合服用均會(huì)引起肝臟代謝有毒物質(zhì)的積累，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷、炎癥發(fā)生的藥源性肝損傷[1]。

梔子來(lái)源于茜草科植物梔子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果實(shí)，性苦、味寒，有瀉火除煩、涼血解毒的功效，主要含有環(huán)烯醚萜類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)和梔子黃色素等成分[2-3]，具有極高的藥用價(jià)值。梔子油占梔子果實(shí)的13%左右[4]。國(guó)內(nèi)外藥理研究表明，梔子油具有鎮(zhèn)靜、提高記憶力、抗氧化、保肝等作用[5-7]。本實(shí)驗(yàn)采用對(duì)乙酰氨基酚建立藥物性肝損傷模型，探討梔子油對(duì)對(duì)乙酰氨基酚所致小鼠急性肝損傷的保護(hù)機(jī)制，為梔子油保肝作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)KM雄性小鼠，體重16～20 g ，共72只，由山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(魯)20140007，于江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)大樓動(dòng)物房飼養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水，適應(yīng)3 d，動(dòng)物房溫度25～28℃、濕度35%～55%。

1.1.2 原料與試劑

梔子，購(gòu)自江西省九江市湖口縣順昌梔子藥材基地，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源學(xué)科羅光明教授鑒定為茜草科植物梔子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果實(shí)。

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT，批號(hào)20171011)、天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(AST，批號(hào)20171007)、白蛋白(ALB，批號(hào)20171014)、還原型谷胱甘肽(GSH，批號(hào)20171028)、超氧化物歧化酶(SOD，批號(hào)20170615)、丙二醛(MDA，批號(hào)20170610)試劑盒，蘇木素-伊紅染液(批號(hào)20170428)，南京建成生物工程研究所；聯(lián)苯雙酯滴丸(生產(chǎn)批號(hào) 170914，每丸1.5 mg)，浙江萬(wàn)邦藥業(yè)股份有限公司；對(duì)乙酰氨基酚片(生產(chǎn)批號(hào)170412,每片0.5 g)，廣東環(huán)球制藥有限公司；吐溫-80。

1.1.3 儀器與設(shè)備

Sartorius bs224s 電子分析天平；DY89-II 電動(dòng)勻漿機(jī)；UV-1800型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，島津公司(日本)；Multiskan Go酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技公司(上海)；Allegra64R 高速冷凍離心機(jī)，Beckman 公司(USA)；JW-3021HR高速冷凍離心機(jī)；DFY-400搖擺式中藥粉碎機(jī)；TKY-BMB型石蠟包埋機(jī)及專(zhuān)用包埋冷臺(tái)；Vortex-Genie 2渦旋混合器，美國(guó)Scientific Industries公司；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋；RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；XHF-D 勻漿機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 供試藥物的提取

取干燥后的梔子，經(jīng)中藥粉碎機(jī)粉碎后，過(guò)20目篩，加5倍量的石油醚，于85℃索氏提取3 h后，旋蒸回收石油醚，得梔子油，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥

將72只KM小鼠隨機(jī)分為6組，分別為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性對(duì)照組(0.2 g/kg)，梔子油低劑量(0.3 g/kg)、中劑量(0.6 g/kg)、高劑量(1.2 g/kg)組。本實(shí)驗(yàn)用0.5%吐溫-80溶液溶解聯(lián)苯雙酯和梔子油。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組正常飲食、飲水，其余各組每天給藥1次，連續(xù)7 d，末次給藥后1 h，除正常對(duì)照組腹腔注射無(wú)菌生理鹽水外，其余各組小鼠一次性腹腔注射450 mg/kg對(duì)乙酰氨基酚制備急性肝損傷模型，禁食不禁水，24 h后摘除小鼠眼球取血，測(cè)定血清生化指標(biāo)，取出肝臟用于肝臟生化指標(biāo)測(cè)定和肝組織病理學(xué)檢查。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定

全血3 000 r/min離心10 min，取上層血清，檢測(cè) ALT、AST和ALB水平；取0.1 g肝臟組織，用4℃生理鹽水制成10%的肝勻漿，離心，取上清液，檢測(cè)SOD、MDA、GSH水平。各指標(biāo)的檢測(cè)均按其試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.4 肝臟組織學(xué)分析

取各組小鼠肝臟相同部位的肝組織，用10%甲醛溶液固定，之后進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片展片、HE染色，在置光鏡下觀察肝組織的損傷程度。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 梔子油對(duì)急性肝損傷小鼠血清 ALT、AST和ALB水平的影響(見(jiàn)表1)

從表1可以看出，與正常組相比，模型組小鼠血清ALT和AST水平顯著升高(p<0.001)，ALB水平顯著降低(p<0.001)，說(shuō)明急性藥物性肝損傷模型建造成功。與模型組相比：聯(lián)苯雙酯組小鼠血清中ALT和AST水平均顯著下降(p<0.001)，ALB水平顯著升高(p<0.001)；梔子油中、高劑量組小鼠血清中ALT和AST水平均具有顯著性降低趨勢(shì)(p<0.01、p<0.001)，ALB水平顯著降低(p<0.001)，且高劑量組優(yōu)于中劑量組，呈劑量依賴(lài)性。表明梔子油對(duì)對(duì)乙酰氨基酚所致小鼠急性肝損傷具有一定的保護(hù)作用。

表1 梔子油對(duì)小鼠血清 ALT、AST和ALB水平的影響

2.2 梔子油對(duì)急性肝損傷小鼠肝臟GSH、SOD和MDA水平的影響(見(jiàn)表2)

從表2可以看出，與正常組比較，模型組小鼠肝組織產(chǎn)生了明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)在MDA水平顯著提高(p<0.001)，GSH和SOD活力顯著降低(p<0.001)。與模型組相比，聯(lián)苯雙酯組GSH和SOD活力顯著升高(p<0.001)；梔子油中、高劑量組MDA 水平顯著降低(p<0.001)，GSH和SOD活力顯著升高(p<0.05、p<0.01、p<0.001)，改善程度高劑量組優(yōu)于中、低劑量組，呈劑量依賴(lài)性。

表2 梔子油對(duì)小鼠肝臟GSH、SOD和MDA水平的影響

2.3 肝臟病理學(xué)檢查(見(jiàn)圖1)

圖1 小鼠肝組織掃描電鏡圖

從圖1可以看出，正常組小鼠肝組織細(xì)胞排列整齊，圍繞中央靜脈呈輻射狀且形態(tài)正常。模型組小鼠肝小葉及匯管區(qū)細(xì)胞可以看到明顯浸潤(rùn)及腫脹現(xiàn)象，中央靜脈周?chē)?xì)胞出現(xiàn)空泡和灶狀壞死。聯(lián)苯雙酯組小鼠肝細(xì)胞則出現(xiàn)明顯改善，腫脹及彌散情況減少，趨于健康。梔子油各劑量組細(xì)胞壞死情況均已得到改觀，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象減弱，細(xì)胞排列趨于整齊，說(shuō)明梔子油對(duì)肝損傷組織具有明顯的保護(hù)作用。

2.4 討論

藥物性肝損傷是指藥物使用過(guò)程中對(duì)機(jī)體肝臟造成的損傷，輕度損傷在停藥后會(huì)慢慢恢復(fù)，重則會(huì)危及生命，所以藥物性肝損傷對(duì)藥物臨床研發(fā)及應(yīng)用有著密切的影響[8]。對(duì)乙酰氨基酚導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)是造成急性肝損傷的主要原因[9]。血清中ALT、AST的水平是評(píng)價(jià)肝損傷程度的敏感指標(biāo)[10]，大劑量使用對(duì)乙酰氨基酚可導(dǎo)致ALT、AST水平在1～3 h內(nèi)升高[11]，實(shí)驗(yàn)中灌胃梔子油后，小鼠ALT和AST水平顯著降低，說(shuō)明梔子油在一定程度上降低了對(duì)乙酰氨基酚對(duì)肝細(xì)胞膜的損害。ALB是一種具有抗氧化和損傷修復(fù)功能的蛋白，小鼠灌胃梔子油后ALB的水平升高說(shuō)明梔子油可以促進(jìn)ALB的分泌與合成，進(jìn)而提高肝細(xì)胞自我修復(fù)能力。GSH是一種廣泛存在于機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶，具有高效清除脂質(zhì)過(guò)氧化物的作用[12]。部分對(duì)乙酰氨基酚進(jìn)入肝臟結(jié)合細(xì)胞色素P450產(chǎn)生大量中間代謝產(chǎn)物N-乙酰對(duì)苯醌亞胺(NAPQI)，該產(chǎn)物有毒性，可與肝臟中谷胱甘肽(GSH)結(jié)合并代謝出體外[13]。梔子油可提高GSH水平進(jìn)而減輕肝損傷的程度。SOD是機(jī)體清除自由基的特異性超氧化物歧化酶，SOD活力的降低直接表明機(jī)體內(nèi)自由基的增加[14]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的重要產(chǎn)物，可引起一系列的交聯(lián)反應(yīng)，并會(huì)引起細(xì)胞損傷，其水平高低間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的程度[15]。相比模型組，使用梔子油后小鼠血清中SOD活力明顯上升、MDA水平顯著下降，表明梔子油可通過(guò)清除氧自由基來(lái)產(chǎn)生對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)對(duì)小鼠腹腔注射高劑量對(duì)乙酰氨基酚溶液，導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)肝臟損傷現(xiàn)象，探討梔子油對(duì)對(duì)乙酰氨基酚致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明，梔子油高、中劑量組小鼠血清中ALT和AST的水平均有明顯下降，ALB、GSH和SOD活性提高，MDA水平降低，肝組織切片顯示肝組織變性及壞死等病理癥狀明顯改善。說(shuō)明梔子油具有清除自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、防止細(xì)胞膜受損、減輕細(xì)胞腫脹壞死的效果，對(duì)藥物所致肝損傷具有顯著保護(hù)作用。綜上所述，梔子油對(duì)對(duì)乙酰氨基酚所致肝損傷具有一定的保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制與提高抗氧化酶體系活力、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、維持肝細(xì)胞膜正常形態(tài)有關(guān)。