超聲輔助-分散液液微萃取/快速液相色譜-串聯質譜法測定食用植物油中黃曲霉毒素

朱筱玲，趙淑娥，羅春麗，熊遠珍

(1.江西省分析測試研究所，南昌 330029； 2.南昌大學 藥學院，南昌 330006)

黃曲霉毒素(AFT)是由黃曲霉和寄生曲霉產生的化學結構類似的系列代謝產物[1]，其中黃曲霉毒素B1(AFB1)是天然的三致性和免疫抑制毒性之首的劇毒物,攝入高含量AFB1食物的人或動物可能會導致肝癌甚至死亡[2]。食用植物油AFB1超標是因花生、玉米、大豆等原料霉變和生產、加工、運輸、儲藏等環節控制不當而受霉菌侵染所致[3]。AFT的耐高溫性與穩定性使其很難被殺滅，用紫外線[4]、微波和光催化可解毒[5]，最新研究表明基因工程及拮抗菌有望抑制產毒菌株生長和毒素產生[6]。然而一級預防措施是制定限量標準，GB 2761—2017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》中植物油脂AFB1限量為(除花生油、玉米油為20 μg/kg外)10 μg/kg。

檢測AFT常用方法有薄層色譜法、酶聯免疫吸附法[7]、高效液相色譜-熒光檢測法[8-10]、液相色譜-質譜聯用法[11-15]等。GB 5009.22—2016《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》均把以上方法列入其中。前3種方法操作煩瑣、重現性差，還可能出現假陽性，難以準確定性定量。用免疫親和柱凈化結合液質聯用技術可特異性提取和高靈敏度準確測定黃曲霉毒素[14-15]，但成本高、耗時長。近年納米材料也用于食用油中的AFB1檢測[16]。分散液液微萃取法(DLLME)始于環境水樣分析前處理[17]，原理是將微升級萃取劑和分散劑的混合液注入萃取體系，在分散劑-樣液相形成萃取劑微珠懸浮于樣液相內，大大擴大萃取劑微珠和樣液相接觸面，使被測物轉移非常迅速，數秒內達平衡而極大提高了萃取率和富集倍數。DLLME用于食品黃曲霉毒素檢測所見不多[13,18],與國標方法相比省去凈化、吹干富集等步驟。超聲輔助(UA)有利于分散乳化使AFT萃取更完全。本文采用UA-DLLME技術，結合液質聯用技術建立UA-DLLME/RRLC-MS/MS分析食用植物油4種黃曲霉毒素方法，具有簡便、高效，準確度和精密度高的優點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

AFB1(1162-65-8)、AFB2(7220-81-7)、AFG1(1165-39-5)、AFG2(7241-98-7)標準溶液，質量濃度均為3 μg/mL，1 mL裝，上海安譜科技公司；甲醇、乙腈、正己烷，色譜純，德國Merck公司；乙醇、丙酮、石油醚(沸程60～90℃)，分析純，西隴科學公司；乙酸銨、甲酸，色譜純，歐盟；實驗用水為屈臣氏飲用水，廣州屈臣氏食品飲料公司。食用植物油為市場抽查的花生油、稻米油、米糠油、菜籽油和調和油樣品。

6410B型三重四級桿串聯質譜儀，配有1200SL快速液相色譜(RRLC)系統，美國Agilent公司；KQ5200DE超聲波清洗器，江蘇昆山市超聲儀器有限公司；XH-B型渦旋混合器，江蘇康健醫療用品公司；TDL-5-A型離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 混合標準溶液的配制

將AFB1、AFB2、AFG1、AFG2標準溶液(1 mL裝)分別用乙腈定容至10 mL容量瓶中，4種儲備液質量濃度均為0.3 μg/mL，4℃冰箱保存。取適量4種標準儲備液用初始流動相稀釋，配制成質量濃度分別為0.625、1.25、2.50、7.50、15.0、30.0 ng/mL的系列混合標準溶液。

1.2.2 液相色譜與質譜條件

1.2.2.1 液相色譜條件[12]

Luna C18(2)100 ?色譜柱(150 mm×2.0 mm，3 μm)；柱溫30℃；進樣量1 μL；流動相A相為乙腈，B相為5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)，0～1.0 min 80%～40% B，1.0～4.0 min 40% B，4.0～4.01 min 40%～80% B；流速0.3 mL/min。

1.2.2.2 質譜條件

電噴霧離子源，正離子掃描模式，干燥氣溫度為300℃，干燥氣流速為10 L/min，毛細管電壓為4 000 V，電噴霧壓力為0.24 MPa。監測離子對、源內碎裂電壓及碰撞氣能量見表1。

表1 4種AFT的MRM掃描參數

1.2.3 樣品前處理

稱取1.0 g樣品于塑料離心管中，加入2 mL石油醚溶解，渦旋混勻。再用1 mL乙腈-水(體積比8∶2)混合均勻，超聲萃取2 min，靜置分層后于4 000 r/min離心5 min，吸取底層溶液(為避免上機溶液夾帶油脂污染儀器，再用適量石油醚分兩次反萃取，棄去上層石油醚)經0.22 μm濾膜過濾后上機。由于沒有購買到標準質控樣，每一定量批次樣品選用其中陰性樣品添加已知質量濃度的4種AFT溶液作為質控。

2 結果與討論

2.1 線性關系考察

配制的4種AFT的質量濃度范圍為0.625～30.0 ng/mL，以質譜儀峰面積的響應值(y)對AFT質量濃度(x)進行線性回歸，其回歸方程和相關系數見表2。由表2可知，4種AFT在0.625～30.0 ng/mL范圍內的線性良好，線性相關系數(R2)均大于0.998。

表2 線性關系和線性范圍

2.2 前處理方法的優化

根據文獻不確定度評估分析[19]，對前處理中影響目標物提取效率的因素進行逐項優化(包括分散劑的種類和體積、萃取劑的種類和體積、萃取時間、離心轉速和離心時間等)。

2.2.1 分散劑、萃取劑及提取方式的篩選

黃曲霉毒素微溶于水，不溶于石油醚、正己烷和乙醚等非極性溶劑，易溶于甲醇、乙腈、丙酮等有機溶劑。油樣黏稠需使用分散劑稀釋，使萃取劑液滴更好地擴散至樣品與被測物接觸。比較了石油醚、正己烷和乙醚3種分散劑及渦旋與超聲兩種提取方式對AFT回收率的影響，結果見圖1。

由圖1可知，乙醚為分散劑時AFT回收率低，石油醚和正己烷為分散劑時AFT回收率較高，超聲提取效果略優于渦旋。理論上石油醚極性與正己烷相似，為己烷和辛烷等系列烷烴混合物，兩者與油脂互溶性好，利于分散，考慮成本選石油醚作分散劑。超聲波對油脂萃取分離的強化作用主要源于其空化效應，而超聲空化又引起了湍動效應、聚能效應、微擾效應和界面效應，因而超聲波可強化萃取分離過程的傳質速率和效果，從而有利于目標物提取。實驗中觀察超聲易形成乳化而增加了溶劑滲透性，配合DLLME過程可提高萃取效率，使目標物易于轉入萃取劑而凈化樣品基質。

圖1 不同分散劑超聲與渦旋提取對AFT回收率的影響

DLLME用的萃取劑應對分析物有良好的親和性，且有良好的色譜行為。篩選了4種萃取劑(甲醇、乙腈、乙醇和丙酮)，發現使用乙醇和丙酮為萃取劑時無法分層，實驗中止。使用甲醇-水或乙腈-水為分散劑可增加其在樣品中的滲透力，提高萃取效率。分別考察4種比例(體積比分別為8∶2、7∶3、6∶4、5∶5)的甲醇-水和乙腈-水對AFT回收率的影響，結果見圖2。由圖2可知，乙腈-水(體積比8∶2)的AFT整體回收率較高，因此選擇乙腈-水(體積比8∶2)為萃取劑。

圖2 不同比例乙腈-水和甲醇-水為萃取劑對AFT回收率的影響

2.2.2 分散劑體積和萃取劑體積對萃取效果的影響

比較了分散劑體積分別為0、1、2、3、4 mL的萃取效果，結果見圖3。由圖3可知，不用分散劑因油樣黏度大難較完全萃取，加入1 mL分散劑明顯優化，2 mL的萃取效果比3、4 mL要好。在分散劑增加的過程可能會出現反萃取，且3、4 mL與萃取劑體積(微升級)相差懸殊，不利于溶液分層得到上機液，所以選擇2 mL作為分散劑體積。

比較了萃取劑體積500、800、1 000、1 200 μL的萃取效果，結果見圖4。由圖4可知，隨著萃取劑體積增大萃取效果先增加，但萃取劑體積為1 200 μL時，萃取效果反而降低。可能隨萃取體積增大富集倍數降低，故選擇萃取劑體積為1 000 μL。

圖3 分散劑體積對AFT回收率的影響

圖4 萃取劑體積對AFT回收率的影響

2.2.3 萃取時間對萃取效果的影響

在石油醚作分散劑(2 mL)、乙腈-水(體積比8∶2)為萃取劑(1 000 μL)等相同條件下，不同超聲輔助萃取時間(2、5、10、15 min)的效果比較見圖5。

圖5 超聲輔助萃取時間對AFT回收率的影響

由圖5可知，超聲2 min時4種黃曲霉毒素回收率均超過85%，延長萃取時間至5 min未見回收率提高，延長至10 min略有降低，再至15 min又稍有增加，原因是隨萃取時間延長會出現反復的反萃取。故選擇超聲輔助萃取2 min，既省時又滿足要求。

2.2.4 離心轉速和離心時間對萃取效果的影響

離心可進一步加速溶液分離，提高萃取效率。考察了離心轉速和離心時間分別為2 000、3 000、4 000、5 000 r/min和3、5、8、10 min時的AFT回收率情況，結果見圖6、圖7。

圖6 離心轉速對AFT回收率的影響

圖7 離心時間對AFT回收率的影響

由圖6、圖7可知，離心轉速4 000 r/min和離心時間5 min為最佳。

2.3 樣品的加標回收率

采用本方法，用陰性樣品加標做回收率實驗，在2.5、15.0、30.0 ng/mL 3個質量濃度水平上進行加標(n=6),同時采用GB 5009.22—2016第一法外標法，用陰性樣品加標做回收率實驗，在30.0 ng/mL質量濃度水平上進行加標(n=6)，結果見表3。由表3可知，采用本方法，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2回收率在88.2%～101.5%之間，在30.0 ng/mL質量濃度水平上回收率分別為100.8%、101.0%、99.7%、98.9%。采用國標方法AFB1、AFB2、AFG1、AFG2在30.0 ng/mL質量濃度水平上加標回收率分別為95.1%、94.8%、93.9%、92.9%，本方法在回收率方面優于國標第一法外標法，其差異具有統計學意義。且本方法樣品用量少，萃取試劑用量少，時間短，不需要柱凈化和蒸發濃縮。受條件限制沒有用同位素內標法進行校正。

表3 加標回收率實驗結果(n=6)

2.4 精密度實驗

以陰性樣品基質標準為例，同一標準樣品重復進樣9次，4種AFT的RSD為3.1%～3.3%。

2.5 基質效應

用初始流動相稀釋的標準溶液與用陰性花生油和稻米油樣作基質配制標準溶液的峰面積做比值，4種AFT的比值在0.95～1.09之間，說明基質效應可忽略。因此，本實驗不采取基質標準溶液作校正。

2.6 樣品測定

用本方法對市場監督抽查的近百批次花生油、米糠油、稻米油、菜籽油和食用調和油進行檢測，其中一批次陽性花生油樣的總離子流圖見圖8。結果檢出花生油AFB1和AFB2最高一批次含量分別高達76.8 μg/kg和23.9 μg/kg，AFB1超過限量值近3倍。原因是花生最易在生長、收獲、儲運過程中霉變產毒，再用此花生加工制油時造成黃曲霉毒素污染。其他油樣均未檢出黃曲霉毒素陽性。

圖8 標準和陽性花生油樣品AFT的總離子流圖

3 結 論

建立了UA-DLLME/RRLC-MS/MS同時測定食用植物油中4種黃曲霉毒素的方法。該方法加標回收率為88.2%～101.5%，相對標準偏差小于3.3%，回收率優于國標第一法外標法，且樣品用量少、萃取劑微量、萃取時間短、不需前處理柱凈化和蒸發濃縮，具有簡單、快速、經濟、準確度和精密度高且環境友好等優點，適合批量油樣定性、定量分析，具有實際參考價值。本研究不足之處是提取物可能殘留少許油脂，對色譜柱和儀器污染造成隱患。除了上機前樣液增加脫脂步驟外，建議在色譜柱前加裝預柱。