復合蛋白酶水解黑豆粕制備多肽的工藝優化

潘進權，蔣 邊，張恩舒，黎華艷

(嶺南師范學院 生命科學與技術學院，廣東 湛江 524048)

黑豆粕是黑豆榨取油脂后的副產物，含有豐富的蛋白質，含量達到40%左右；黑豆粕中蛋白質的氨基酸組成均衡，營養價值較高，是一類優質的植物蛋白資源[1]。長期以來，黑豆粕被廣泛用作飼料蛋白原料，用來替代魚粉[2]。但是黑豆粕中含有多種抗營養因子，如胰蛋白酶抑制因子、大豆抗原蛋白、寡糖等，這些抗營養因子不但阻礙了飼料中營養成分的消化、吸收和利用，而且也會對動物的生長發育和健康造成不良影響[3]。此外，黑豆粕的蛋白質分子是高度壓縮折疊的，本身較難消化吸收，利用率較低[4-6]。因此，對黑豆粕進行改性加工，提高其蛋白資源的利用率至關重要。

目前，國內外對黑豆蛋白資源的研究大多集中在蛋白質的提取工藝方面[7-9]，而對黑豆蛋白的深加工及改性研究相對較少。已有的研究表明，蛋白質原料經水解得到的多肽混合物具有比原料蛋白及氨基酸混合物更優越的食品加工性能及營養價值[10-12]；而且多肽制品通常具有一定的生理保健功能，如抗氧化、抗腫瘤、增強免疫力等[13-15]。因此，作為一種新型的氮素營養物質，多肽制品具有更廣闊的使用空間。鑒于此，本研究提出了復合蛋白酶水解黑豆粕高效制備多肽的工藝路線，通過復合蛋白酶對黑豆粕蛋白質進行深度水解，制備酸溶性好、宜消化吸收的多肽制品，這樣既克服了黑豆粕在營養上的不足，同時可賦予多肽制品一定的生理保健功能。研究結果將為黑豆粕蛋白資源的加工與利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黑豆粕(粗蛋白質含量為42.44%)，吉林省億源生態產品有限公司。中性蛋白酶(116.2 U/mg)，諾維信酶制劑公司；木瓜蛋白酶(105.1 U/mg)，北京鼎國生物技術有限責任公司；米曲霉蛋白酶(254.4 U/mg)、桔青霉蛋白酶(182.4 U/mg)、微生物中性蛋白酶(214.1 U/mg)，實驗室自制；胰蛋白酶(242.2 U/mg)，國藥集團化學試劑有限公司；堿性蛋白酶(182.4 U/mg)，南京奧多福尼生物科技有限公司；以上蛋白酶酶活均按照 GB/T 23527—2009，采用Folin-酚法測定。其他試劑均為國產分析純。

SKD-08S2紅外智能消化爐，SKD-600自動凱氏定氮儀，HJ-2A數顯恒溫多頭磁力攪拌器，PHS-3C數顯pH計，L550低速離心機，FA3204B電子天平。

1.2 試驗方法

1.2.1 蛋白酶水解黑豆粕的工藝流程

黑豆粕→粉碎過100目篩→配制黑豆粕溶液→調節pH→加入蛋白酶→保溫水解→調節pH→沸水浴滅酶→離心分離→蛋白水解液。

操作要點：用蒸餾水配制蛋白質量濃度為30 g/L 的黑豆粕溶液，調節pH為8.0，按照4 000 U/g(以蛋白質量計，下同)的加酶量加入蛋白酶制劑，混勻后置于45℃水浴中保溫水解4 h，期間通過滴加1 mol/L的NaOH溶液維持水解體系pH的穩定；水解結束后調節pH到4.5，然后將水解液置于沸水浴滅酶10 min，在4 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液，得到蛋白水解液。

1.2.2 多肽得率的測定

按照GB 5009.5—2016采用凱氏定氮法測定樣品中蛋白質的質量濃度， 按照GB/T 22492—2008測定水解液中多肽的質量濃度。按下式計算多肽得率。

多肽得率=水解液中多肽的總量/原料蛋白質總量×100%

1.2.3 多肽的電泳分析

采用Tricine-SDS-PAGE電泳系統[16]，16.5%分離膠(添加分離膠體積10%的甘油)，10%夾層膠，4%濃縮膠。點樣后30 V跑1 h后，待指示前沿到達分離膠上沿時，把電壓調至90 V，恒壓至電泳結束。

1.2.4 多肽與黑豆粕蛋白的氨基酸組成分析

參照GB 5009.124—2016測定多肽的氨基酸組成：5 mL蛋白水解液加入2 mol/L的三氯乙酸5 mL，充分混勻后靜置10 min，然后于8 000 r/min離心10 min，收集上清液；取1 mL上清液(或0.3 g黑豆粕粉)于水解管內，加入15 mL 6 mol/L的鹽酸，在110℃水解22 h，取水解后的樣液利用氨基酸自動分析儀測定各種氨基酸的含量。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

按照1.2.1所述方法，分別采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、微生物中性蛋白酶、米曲霉蛋白酶、桔青霉蛋白酶，在各蛋白酶適宜的條件下進行黑豆粕水解試驗，通過測定各水解液的多肽得率比較不同蛋白酶對黑豆粕水解效果的差異，并由此確定適合黑豆粕水解的主要蛋白酶類型，結果如表1所示。

表1 不同蛋白酶對黑豆粕水解效果的比較

由表1可以看出：胰蛋白酶與堿性蛋白酶對黑豆粕的水解效果相對最好，其水解液的多肽得率顯著高于其他幾種蛋白酶，說明這兩種蛋白酶的肽鍵選擇性對黑豆粕蛋白的肽鍵組成及分布有較好的適應性；木瓜蛋白酶與中性蛋白酶對黑豆粕的水解能力較差，顯示出較差的適應性。根據上述試驗結果，可確定水解黑豆粕的主要蛋白酶為胰蛋白酶與堿性蛋白酶。

2.2 蛋白酶的復配

分別以胰蛋白酶或堿性蛋白酶與其他幾種蛋白酶按酶活比1∶1配制復合蛋白酶液；按照1.2.1的方法進行水解試驗，測定各水解液的多肽得率，比較不同復合蛋白酶對黑豆粕水解性能的差異，以及各蛋白酶之間的協同作用效果，由此確定黑豆粕水解的最佳復合蛋白酶組成，結果如表2所示。

表2 不同復合蛋白酶對黑豆粕水解效果的比較 %

由表2可以看出：堿性蛋白酶或胰蛋白酶與其他幾種蛋白酶組成的復合蛋白酶對黑豆粕的水解效果顯著優于單一蛋白酶的試驗結果，這說明各蛋白酶之間存在一定的肽鍵互補性；胰蛋白酶、堿性蛋白酶與桔青霉蛋白酶三者之間表現出較強的協同作用效果；胰蛋白酶與米曲霉蛋白酶，堿性蛋白酶與微生物中性蛋白酶之間有較弱的協同作用效果。根據以上試驗結果可以初步確定以堿性蛋白酶、胰蛋白酶及桔青霉蛋白酶三者來構建復合蛋白酶，其中堿性蛋白酶與胰蛋白酶作為復合蛋白酶的主酶，桔青霉蛋白酶作為輔助蛋白酶成分。

2.3 蛋白酶的復配比例

設計堿性蛋白酶與胰蛋白酶不同的酶活比進行復配配制復合蛋白酶，按照1.2.1的方法進行黑豆粕水解試驗，測定各水解液的多肽得率，結果如表3所示。

表3 胰蛋白酶與堿性蛋白酶配比對黑豆粕水解效果的影響

由表3可知，胰蛋白酶與堿性蛋白酶配比對復合蛋白酶水解黑豆粕的效率有顯著的影響。主酶中起主導作用的是堿性蛋白酶，適當加大堿性蛋白酶的比例可顯著提高復合蛋白酶對黑豆粕的水解效率。根據試驗結果可確定胰蛋白酶與堿性蛋白酶較合適的復配比例為1∶3。在固定主酶配比的前提下，分析了桔青霉蛋白酶添加比例對復合蛋白酶水解效率的影響，結果見表4。

表4 主酶與輔助酶配比對黑豆粕水解效果的影響

由表4可知，主酶與輔酶配比對復合蛋白酶水解黑豆粕的效果有顯著的影響。主酶中添加適量的桔青霉蛋白酶可以顯著提高復合蛋白酶的作用效果，主輔酶的適宜配比為2∶1。根據以上試驗結果，經綜合考慮確定了適合黑豆粕水解的最佳蛋白酶是由胰蛋白酶、堿性蛋白酶與桔青霉蛋白酶按照酶活比1∶3∶2配制而成的復合蛋白酶。此試驗結果與文獻報道的大豆蛋白水解最適復合蛋白酶的組成相類似[17]，說明這兩種植物蛋白的結構及肽鍵組成較為接近。

2.4 水解工藝的單因素試驗

2.4.1 底物蛋白質量濃度對水解工藝的影響

用蒸餾水配制黑豆粕溶液，使底物蛋白質量濃度分別為10、20、30、40、50、60、70 g/L，采用優化后的復合蛋白酶，按照1.2.1的方法進行水解試驗，考察底物蛋白質量濃度對黑豆粕水解工藝的影響，結果如圖1所示。

圖1 底物蛋白質量濃度對黑豆粕水解工藝的影響

由圖1可知：當水解體系的底物蛋白質量濃度較低時，多肽得率相對較高，說明黑豆粕中蛋白的溶出較充分，溶液中蛋白的水解較完全；隨著水解體系中底物蛋白質量濃度的增加，多肽得率呈現下降趨勢，尤其是當底物蛋白質量濃度超過40 g/L后下降趨勢更顯著，說明蛋白的水解程度降低了，水解不充分。這是由于隨著體系底物蛋白質量濃度的增加，水解體系中多肽濃度隨之增加，多肽類產物對蛋白酶的反饋抑制作用增強，從而導致水解體系中有效酶活降低；此外，水解體系的黏稠度會隨著底物濃度的增加而迅速上升，蛋白從黑豆粕組織中溶出的速率減慢，從而降低了蛋白的水解效率。根據上述結果確定適宜的底物蛋白質量濃度為40 g/L。

2.4.2 加酶量對水解工藝的影響

采用優化后的復合蛋白酶，分別以500、1 000、2 000、3 000、4 000、5 000、6 000、7 000 U/g的加酶量，按照1.2.1的方法進行水解試驗，考察加酶量對黑豆粕水解工藝的影響，結果如圖2所示。

圖2 加酶量對黑豆粕水解工藝的影響

由圖2可知：加酶量對水解工藝有顯著影響。當底物蛋白質量濃度為30 g/L時，隨著加酶量的增加，多肽得率呈現不斷上升的趨勢；當加酶量達到6 000 U/g以上，多肽得率增長較緩慢，說明此時的加酶量相對于底物蛋白已趨于飽和。根據試驗結果可初步確定適宜的加酶量在6 000 U/g左右。

2.4.3 pH對水解工藝的影響

采用優化后的復合蛋白酶，按照1.2.1的方法分別在pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的條件下進行水解試驗，考察pH對黑豆粕水解工藝的影響，結果如圖3所示。

圖3 pH對黑豆粕水解工藝的影響

由圖3可知，pH對多肽得率有較顯著的影響。在弱酸性條件下多肽得率顯著偏低。弱堿性的環境有利于蛋白水解及多肽得率的提高。這應該與復合蛋白酶在堿性條件下有最佳催化活性密切相關；另外，黑豆粕蛋白在堿性條件下有更好的水溶特性，堿性環境有助于黑豆粕蛋白的溶出以及在水溶液中的分散，更有利于蛋白與酶的結合及水解反應的發生。綜合上述試驗結果初步確定水解體系適宜的pH在10.0左右。

2.4.4 水解溫度對水解工藝的影響

采用優化后的復合蛋白酶，按照1.2.1的方法分別在30、35、40、45、50、55、60、65℃的條件下進行水解試驗，考察水解溫度對黑豆粕水解工藝的影響，結果如圖4所示。

圖4 水解溫度對黑豆粕水解工藝的影響

由圖4可知，當水解溫度低于55℃時，水解體系的多肽得率隨著水解溫度的升高而增加，說明黑豆粕蛋白的水解程度逐步上升，這是由于適當的升溫可以提高蛋白酶的催化活性，有助于黑豆粕蛋白的溶出，提高溶液中底物蛋白的濃度，使蛋白水解更充分。當水解溫度高于55℃之后，多肽得率隨著水解溫度的升高而迅速下降，這是由于高溫導致了蛋白酶變性失活，水解體系中蛋白酶的有效活性降低，豆粕蛋白水解不完全。根據上述試驗結果，可初步確定水解體系適宜的水解溫度在55℃左右。

2.4.5 水解時間對水解工藝的影響

采用優化后的復合蛋白酶，按照1.2.1所述方法分別在水解0.5、1、2、3、4、5、6、7 h條件下進行水解試驗，考察水解時間對黑豆粕水解工藝的影響，結果如圖5所示。

圖5 水解時間對黑豆粕水解工藝的影響

由圖5可知：在水解的前1 h內，蛋白水解最為迅速，體系中多肽得率的增長速度最快；在水解的中期(1～5 h)，隨著體系中底物蛋白濃度的降低，以及蛋白酶活性的下降，蛋白水解速度減慢，體系中多肽得率呈現緩慢的增長；在水解的后期(5 h以后)，水解體系的多肽得率基本趨于穩定，說明水解反應已基本終止。根據上述試驗結果，可確定適宜的水解時間在6 h左右。

2.5 水解工藝的響應面試驗

根據單因素試驗，確定了加酶量、水解溫度及pH對黑豆粕水解工藝有較顯著影響。在固定底物蛋白質量濃度40 g/L、水解時間6 h的前提下，以多肽得率(Y)為響應值，運用Design Expert軟件的Central Composite試驗設計針對以上3個因素進行中心組合試驗及響應面分析，響應面試驗因素水平如表5所示，響應面試驗設計及結果如表6所示。

表5 響應面試驗因素水平

表6 響應面試驗設計及結果

續表6

根據表6試驗結果，以多肽得率為響應值，加酶量(A)、水解溫度(B)和pH(C)為變量進行曲線擬合，可以構建變量與響應值之間的數學模型：Y=80.64+4.28A+0.89B-2.33C-0.88AB-0.29AC+0.71BC-3.30A2-8.32B2-2.82C2。

運用Design Expert軟件對數學模型及表6中數據進行方差分析，結果如表7所示。

表7 響應面試驗結果的方差分析

由表7可知，模型極顯著(P<0.01)，模型的相關系數R2為0.996 8，模型的失擬項不顯著(P=0.689 1>0.1)，由此說明以上模型對試驗結果有非常高的擬合度，模型可用于對各因素取值范圍內的試驗結果進行預測及優化。對各因素項進行顯著性分析，其結果顯示加酶量(A)、水解溫度(B)和pH(C)對黑豆粕水解工藝有極顯著的影響，單一因素對多肽得率呈現非線性(二次項極顯著)的相互關系；此外，因素A和B之是存在極顯著的交互作用(P<0.01)，因素B和C之間存在顯著的交互作用(P<0.05)。

運用Design Expert軟件優化得到最優工藝條件為加酶量5 670 U/g、水解溫度50℃、pH 9.55，在此條件下預測的最大響應值為82.60%。綜合單因素試驗及響應面試驗結果可以確定復合蛋白酶水解黑豆粕的最佳工藝條件為：胰蛋白酶、堿性蛋白酶與桔青霉蛋白酶按酶活比1∶3∶2配制復合蛋白酶，加酶量5 670 U/g，底物蛋白質量濃度40 g/L，pH 9.55，水解溫度50℃，水解時間6 h。在優化的工藝條件下進行了6次驗證試驗，多肽得率分別為82.78%、81.89%、82.34%、83.06%、82.58%、81.96%，平均值為82.44%，此結果與模型預測的最大響應值相接近，進一步驗證了上述數學模型的可靠性。試驗結果表明，優化后的復合蛋白酶及其水解黑豆粕工藝可實現黑豆粕蛋白的高效轉化，其多肽得率遠高于已有的文獻報道結果[18]。

2.6 黑豆粕水解液的電泳分析

除水解時間外，用優化后的工藝條件進行復合蛋白酶水解黑豆粕試驗，采用Tricine-SDS-PAGE電泳系統對黑豆粕水解液進行了分析，電泳圖譜如圖6所示。

由圖6可以看出，復合酶對黑豆粕蛋白的水解程度較高，多肽的相對分子質量集中在7.8 kDa以下。比較b～e 4個泳道的條帶分布及顏色深淺可以發現，隨著水解時間的延長，水解液中大分子(10 kDa以上)片段的肽逐漸減少直至消失。然而中等相對分子質量(6 kDa左右)的肽并沒有因此而增加，反而呈現出遞減的趨勢，說明水解液中有相當一部分肽是以更小相對分子質量(3.3 kDa以下)的形式存在。這部分肽因相對分子質量小，在電泳中擴散到電泳膠片以外，因此未能在電泳膠片上顯色出來。另外，泳道d和e的條帶情況基本一致，這說明5 h后黑豆粕蛋白的水解已基本結束，此結果與前述單因素試驗結果相吻合。

注：a.超低相對分子質量Marker；b.水解0.5 h的樣液；c.水解3 h的樣液；d.水解5 h的樣液；e.水解7 h的樣液。

2.7 多肽的氨基酸組成

采用優化后的工藝條件進行復合蛋白酶水解黑豆粕試驗，用氨基酸自動分析儀測定水解液中多肽的氨基酸組成，并與黑豆粕蛋白的氨基酸組成比較，結果如表8所示。

表8 黑豆粕蛋白及水解液中多肽的氨基酸組成

由表8可以看出：黑豆粕蛋白具有較好的營養價值，其含有動物體所需的17種氨基酸(因檢測條件限制沒能檢測色氨酸)，8種必需氨基酸占氨基酸總量達到35%以上；對比黑豆粕蛋白與水解液中多肽的氨基酸組成可以看出，多肽的氨基酸組成與黑豆粕蛋白的氨基酸組成基本一致；水解后,僅有谷氨酸與苯丙氨酸占氨基酸總量的比例有較顯著的增加,含硫氨基酸在水解中有少量的損失，其他幾種氨基酸占氨基酸總量的比例變化均不顯著。由此說明，經復合蛋白酶水解制備的多肽具有與黑豆粕蛋白相類似的營養價值。

3 結 論

為有效利用黑豆粕蛋白資源，考察了復合蛋白酶水解黑豆粕制備多肽的工藝路線。從蛋白酶的篩選入手，考察了不同蛋白酶對黑豆粕的水解效果差異。結果顯示：胰蛋白酶對黑豆粕蛋白有最高的水解效率，其次是堿性蛋白酶；中性蛋白酶對黑豆粕蛋白的水解效率最低；胰蛋白酶、堿性蛋白酶與桔青霉蛋白酶三者間有較顯著的協同作用，由三者配伍構建的復合蛋白酶的水解效率遠高于單一蛋白酶的水解效率。通過復配比例優化確定了復合蛋白酶的最佳組成為胰蛋白酶、堿性蛋白酶與桔青霉蛋白酶按酶活比1∶3∶2的比例復配。采用單因素及響應面試驗對復合蛋白酶水解黑豆粕的工藝條件進行了探究，確定最佳工藝條件為：復合蛋白酶加酶量5 670 U/g，底物蛋白質量濃度40 g/L，pH 9.55，水解溫度50℃，水解時間6 h。在最佳工藝條件下，多肽得率達到82.44%。對水解液中多肽進行了電泳分析，結果發現水解液中多肽的相對分子質量均在7.8 kDa以下，大部分以小肽的形式存在，相對分子質量分布在3.3 kDa以下。說明優化的復合蛋白酶可實現黑豆粕蛋白的深度水解，將黑豆粕蛋白高效轉化為小分子肽。對水解液中多肽的氨基酸組成進行了分析，結果顯示，多肽具有與黑豆粕蛋白相似的氨基酸組成，營養價值較高。綜合以上結果可以看出，采用優化后的復合蛋白酶水解黑豆粕高效制備多肽的工藝路線具有可行性。