牡丹籽油復方軟膠囊增強免疫力的功能研究

張夢蘭，楊 琴，張冰潔，王洪新，馬朝陽

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122)

牡丹籽油是一種新型食用油脂，已于2011年獲批為新資源食品。牡丹籽油中富含不飽和脂肪酸(>82%)，主要成分為α-亞麻酸(>38%)，還含有黃酮、甾醇等多種藥理活性成分[1]。研究表明，牡丹籽油具有抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、免疫增強、保護急性肝損傷等多種功效[2-6]。另外，姚思宇等[7]研究表明，α-亞麻酸能增強小鼠的免疫力，提高NK細胞活性，增強巨噬細胞吞噬能力。

茶葉提取物可以回升荷瘤小鼠的T細胞和NK細胞活性，其中：茶氨酸可以增強巨噬細胞吞噬活性和NK細胞活性；茶葉多糖可以顯著增強IL-2、IFN-γ 水平；茶多酚可提高血清中免疫球蛋白IgG、IgM、IgA的含量,可延緩胸腺衰退，保護淋巴細胞受損，促進胸腺淋巴細胞增殖，增強人體免疫功能[8-12]。

苦瓜果肉可誘導IFN-γ 產生，促進巨噬細胞的激活；苦瓜提取液可以明顯增強小鼠的非特異性免疫和體液免疫功能，其中苦瓜皂甙可通過改變T細胞各亞群比例,促進脾臟分泌IL-2,增強腹腔巨噬細胞分泌TNF-α的能力和吞噬指數；苦瓜多糖能刺激小鼠脾淋巴細胞增殖,提高巨噬細胞吞噬中性紅、分泌NO的能力[13-16]。

現代社會忙碌的工作和學習使得免疫力低下的亞健康人群增多，關于增強免疫力保健品的研究也越來越多。因此，我們選擇了上述3種可以增強免疫力的食品原料復配以期達到多靶點、多途徑增強免疫力的目的，并且按照衛生部頒布的《保健食品檢驗與評價技術規范 增強免疫力功能評價方法(征求意見稿)》(2012版)的要求，對由上述3種原料組成的牡丹籽油復方軟膠囊的增強免疫功效進行了研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 受試物

牡丹籽油復方軟膠囊(內容物配方為牡丹籽油、茶葉提取物、苦瓜提取物，三者質量比15∶5∶3)，由安徽哈博藥業有限公司提供，人體推薦量0.06 g/(kg·d)；牡丹籽油(α-亞麻酸含量>38%)，銅陵瑞璞牡丹產業發展有限公司；茶葉提取物(茶多酚含量>30%)，遵義陸圣康源有限公司；苦瓜提取物(苦瓜總皂甙含量>1.5%)，桂林萊茵生物科技有限公司。

1.1.2 實驗動物

C57BL/6J小鼠，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，生產許可證號為SCXK(滬)2013-0018，SPF級，雄性，體重18～22 g。小鼠飼養于江南大學動物房，實驗動物使用許可證號為SYXK(蘇)2016-0045，實驗環境條件為室溫20～26℃、相對濕度40%～70%、光照/黑暗周期12 h/12 h。

1.1.3 主要試劑

刀豆蛋白A(ConA)，西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；2,4-二硝基氟苯(DNFB)、綿羊紅細胞(SRBC)、RPMI 1640培養基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素混合溶液、Hank’s液、豚鼠血清、瓊脂糖、二甲氧唑黃(XTT)試劑盒，上海哈靈生物科技有限公司；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒，南京建成生物工程研究所；印度墨汁，北京化學試劑公司；YAC-1細胞，中科院上海細胞庫；單分散熒光微球(聚苯乙烯微球)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；牛血清白蛋白(BSA)、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、硫化鋇，國藥集團化學試劑有限公司。完全培養基：RPMI 1640培養液過濾除菌，用前加入10%胎牛血清、1%谷氨酰胺(200 mmol/L)、青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(100 μg/L)及5×10-5mol/L的2-巰基乙醇，用無菌的1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調pH至7.0～7.2。ConA液：用雙蒸水配制成100 μg/mL的溶液，過濾除菌，于-20℃保存。

1.1.4 主要儀器

UV-2100紫外分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司；AR224CN電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；ELISA全自動酶標儀，濟南博鑫生物技術有限公司；CO2培養箱、生物安全柜，賽默飛世爾科技公司；耳腫打孔器，北京環球生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 淋巴細胞體外增殖實驗(XTT法)

脫頸椎處死小鼠，無菌取脾，將脾磨碎后，用全自動細胞計數儀計數活細胞，調整濃度為2×107個/mL，取100 μL加入96孔板；用完全培養基分別配制牡丹籽油、茶葉提取物和苦瓜提取物不同濃度的樣液，對照組加100 μL完全培養基，過無菌濾膜，加入上述培養板中，每個樣做6個平行，其中3個孔加入7.5 μL ConA液，分別加入完全培養基補足體積至200 μL，使得培養時樣品質量濃度分別為4、6、8 mg/mL。在CO2培養箱中孵育72 h，結束前4 h加入XTT，用酶標儀在450 nm處檢測光密度。計算不加ConA的孔和加入ConA的孔的光密度差值[17]，以光密度差值表征淋巴細胞體外增殖能力。

培養方法同上，以8 mg/mL為總作用質量濃度，根據牡丹籽油復方軟膠囊3種成分比例計算得到牡丹籽油、茶葉提取物、苦瓜提取物的質量濃度分別為5.22、1.74、1.04 mg/mL，以對照組、牡丹籽油組(A組)、茶葉提取物組(B組)、苦瓜提取物組(C組)、牡丹籽油+茶葉提取物組(A+B組)、牡丹籽油+苦瓜提取物組(A+C組)、茶葉提取物+苦瓜提取物組(B+C組)和牡丹籽油+茶葉提取物+苦瓜提取物組(A+B+C組)為受試樣液，測定各組對淋巴細胞的體外增殖能力。

1.2.2 動物分組與給藥

將160只小鼠隨機分為4個大組：免疫I組，進行ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉化實驗、NK細胞活性的測定；免疫Ⅱ組，進行遲發型變態反應實驗和臟體比測定；免疫Ⅲ組，進行小鼠腹腔巨噬細胞吞噬熒光微球實驗，抗體生成細胞數的測定；免疫Ⅳ組，進行碳廓清實驗。每個大組隨機分為4個小組，每組10只，分別為陰性對照組和低、中、高劑量組。

以人體推薦攝入量的5、10、30倍，設置低、中、高3個劑量組，分別為0.3、0.6、1.8 g/(kg·d)，其中α-亞麻酸劑量分別為74.4、148.8、446.4 mg/(kg·d)。小鼠灌胃體積為10 mL/kg。取牡丹籽油復方軟膠囊內容物3、6、18 g，分別用1%羧甲基纖維素鈉水溶液定容至100 mL，即為不同質量濃度的灌胃劑。各組灌胃給予受試物，陰性對照組給予等體積1%羧甲基纖維素鈉水溶液，每天1次，連續灌胃1個月。

1.2.3 臟體比測定

脫頸椎處死動物，取其胸腺及脾臟，稱重，計算胸體比和脾體比。

1.2.4 ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉化實驗(XTT法)

脫頸椎處死動物，無菌取脾，將脾磨碎后，用全自動細胞計數儀計數活細胞，調整濃度為5×107個/mL，取100 μL加入96孔板，每個動物做4個平行，其中2個孔加入7.5 μL ConA液，2個孔不加，然后所有孔加入完全培養基補足體積至200 μL，在CO2培養箱中孵育72 h，結束前4 h加入XTT，用酶標儀在450 nm處檢測每孔的光密度。計算不加ConA的孔和加入ConA的孔光密度的差值[18]。

1.2.5 二硝基氟苯誘導小鼠遲發型變態反應(DTH)

在給藥實驗結束前6 d，每鼠腹部皮膚用硫化鋇脫毛，范圍約3 cm×3 cm，用DNFB溶液50 μL均勻涂抹致敏。5 d后，用DNFB溶液10 μL均勻涂抹于小鼠右耳(兩面)進行攻擊。攻擊24 h后頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼。用打孔器取下直徑8 mm的耳片，稱重，并計算左右耳片的質量差[18]。

1.2.6 抗體生成細胞數的測定

在給藥實驗結束前5 d，每鼠腹腔注射0.2 mL 2%壓積SRBC，5 d后脫頸椎處死小鼠，脾細胞磨碎后用RPMI 1640培養基制備成(5～10)×106個/mL 的懸液，在底層培養基(0.5 g瓊脂糖加入100 mL滅菌生理鹽水中，加熱溶解，50℃左右時，以1 mL/孔的量加至6孔培養板中，瓊脂凝固后備用)上加入脾細胞懸液和頂層培養基(0.5 g瓊脂糖加入100 mL Hank’s液(pH 7.2～7.4)中,加熱溶解，以0.5 mL/試管的量加至46～50℃恒溫的試管中)，將培養板放入CO2培養箱中孵育1 h，然后每孔加入500 μL補體，繼續孵育2 h，自動圖像分析儀讀取溶血空斑圖像,分析軟件計數溶血空斑數[18]。

1.2.7 小鼠碳廓清實驗

每鼠尾靜脈注入用生理鹽水稀釋4倍的印度墨汁，注射量按0.1 mL/10 g計算，待墨汁注入后，立即計時。注入墨汁后第2、10 min，分別從內眥靜脈叢取血20 μL，加入到2 mL 0.1% Na2CO3溶液中，在600 nm波長處測定光密度。第二次采血結束后，立即處死小鼠，取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重，計算吞噬指數[18]。

式中：OD1和OD2分別為血樣在2、10 min時測定的光密度。

1.2.8 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬熒光微球實驗

脫頸椎處死小鼠，腹腔注射3 mL加胎牛血清的Hank’s液，輕輕按揉腹部充分洗出腹腔巨噬細胞，然后將腹壁剪開一個小口，吸取腹腔洗液2 mL，用75 μm過濾器過濾至試管內，調整巨噬細胞數為(4～6)×105個/mL,取1 mL于6孔培養板中，加入熒光微球，CO2培養箱37℃避光孵育90～120 min，棄上清，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后，用細胞刮刮下貼壁細胞，吹打均勻，過濾，上流式細胞儀檢測分析，計算吞噬率和吞噬指數[18]。

吞噬率=吞噬熒光微球的巨噬細胞數/計數的巨噬細胞數×100%

吞噬指數=被吞噬的熒光微球總數/計數的巨噬細胞數

1.2.9 NK細胞活性的測定

無菌取小鼠的脾，將脾磨碎并裂解紅細胞后，用全自動細胞計數儀計數活細胞，調整濃度為2×107個/mL，調整靶細胞(YAC-1)濃度至4×105個/mL，在U型96孔板中加入100 μL靶細胞和100 μL效應細胞(NK細胞)即為反應孔，加入100 μL靶細胞和100 μL培養液即為自然釋放孔，加入100 μL靶細胞和100 μL 2.5% Triton即為最大釋放孔。于37℃ CO2培養箱培養4 h，離心后吸取上清液100 μL于平底96孔板中，加入LDH，反應3 min后加入250 μL 0.4 mol/L NaOH溶液，測定490 nm處的光密度，并計算NK細胞活性[18]。

NK細胞活性=(反應孔OD-自然釋放孔OD)/(最大釋放孔OD-自然釋放孔OD)×100%

1.2.10 數據處理與結果判定

采用SPSS 10.0統計軟件分析。根據《保健食品檢驗與評價技術規范》，在細胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細胞功能、NK 細胞活性4個方面任何2個方面結果為陽性，可判定該受試樣品具有增強免疫力的功能。在每個方面需要該方面下的2個實驗結果均為陽性，或NK細胞活性測定實驗的1個以上劑量結果為陽性，才能判定該方面的結果為陽性[17-18]。

2 結果與討論

2.1 受試物對小鼠淋巴細胞體外增殖能力的影響(見表1、表2)

表1 3種質量濃度受試物對小鼠淋巴細胞體外增殖能力的影響

由表1可知，茶葉提取物在4、6、8 mg/mL時均可以顯著增強小鼠淋巴細胞體外增殖能力，苦瓜提取物在6、8 mg/mL時可以顯著增強小鼠淋巴細胞體外增殖能力，而牡丹籽油在8 mg/mL時能顯著增強小鼠淋巴細胞體外增殖能力。在相同質量濃度時，茶葉提取物增強小鼠淋巴細胞體外增殖能力的效果最好。

表2 在復方軟膠囊配方比例下受試物對小鼠淋巴細胞體外增殖能力的影響

由表2可知，在復方軟膠囊的配方比例下，苦瓜提取物對小鼠淋巴細胞體外增殖能力幾乎沒有增強效果，茶葉提取物和牡丹籽油則具有顯著增強效果，且茶葉提取物的效果強于牡丹籽油，3種成分之間并不具有拮抗作用。該配方中，茶葉提取物起主要作用，牡丹籽油次之，最后是苦瓜提取物。

2.2 受試物對小鼠體重的影響(見表3)

表3 受試物對小鼠體重增長率的影響

由表3可知，各大組的3種劑量組的小鼠體重增長率與陰性對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)。說明受試物不會影響正常小鼠的體重。

2.3 受試物對小鼠臟體比的影響(見表4)

表4 受試物對小鼠臟體比的影響

由表4可知，與陰性對照組比較，3個劑量組小鼠胸體比與脾體比均無顯著性差異(P>0.05)。說明不能通過增加免疫器官的質量來發揮增強免疫力的作用。

2.4 受試物對ConA 誘導的小鼠淋巴細胞增殖能力的影響(見表5)

表5 受試物對ConA 誘導的小鼠淋巴細胞增殖能力的影響

由表5可知，各劑量組小鼠淋巴細胞增殖能力均增加，與陰性對照組比較，中劑量組差異顯著(P<0.05)，高劑量組差異極顯著(P<0.01)。這說明受試物能顯著增強小鼠的淋巴細胞增殖能力，增強細胞免疫功能。有研究表明茶多酚可保護淋巴細胞受損、促進淋巴細胞增殖，這可能是脾臟中原始細胞向T細胞分化的結果；苦瓜皂甙和α-亞麻酸均可以增強CD8+細胞的增殖，降低CD4+/CD8+比值，改善機體免疫狀態；苦瓜多糖能刺激小鼠淋巴細胞增殖[12,15-16，19]。

2.5 受試物對DNFB誘導小鼠DTH的影響(見表6)

表6 受試物對DNFB誘導小鼠DTH的影響

由表6可知，各劑量組小鼠左右耳質量差值均增加，與陰性對照組比較，差異均有顯著性意義(P<0.05)。這說明該受試物可以顯著增強小鼠的細胞免疫功能。有研究表明給藥量為88.8 mg/kg 純α-亞麻酸時，可顯著增加小鼠左右耳質量差值，增強遲發型變態反應，本實驗低劑量組中牡丹籽油的添加量按α-亞麻酸計為74.4 mg/kg ，實驗結果與文獻[7]結果一致。

2.6 受試物對小鼠抗體生成細胞數的影響(見表7)

表7 受試物對小鼠抗體生成細胞數的影響

由表7可知，與對照組比較，各劑量組小鼠的溶血空斑數均不具有顯著性差異(P>0.05)。這說明該受試物不能顯著增強小鼠的體液免疫功能。

2.7 受試物對小鼠碳廓清實驗吞噬指數的影響(見表8)

表8 受試物對小鼠碳廓清實驗吞噬指數的影響

由表8可知，高劑量組小鼠的吞噬指數與對照組比較，差異有顯著性意義(P<0.05)。說明該受試物可以增強小鼠的碳廓清能力。有研究表明給藥量為355.4 mg/kg 純α-亞麻酸，可顯著提高小鼠碳廓清能力，本實驗高劑量組α-亞麻酸劑量為446.4 mg/kg，實驗結果與文獻[7]結果一致。

2.8 受試物對小鼠巨噬細胞吞噬熒光微球的影響(見表9)

表9 受試物對小鼠巨噬細胞吞噬能力的影響

由表9可知，與對照組比較，各劑量組小鼠的吞噬率和吞噬指數差異均不具有顯著性意義(P>0.05)。說明該受試物不能增強小鼠的巨噬細胞吞噬功能。

2.9 受試物對小鼠NK細胞活性的影響(見表10)

表10 受試物對小鼠NK細胞活性的影響

由表10可知，與對照組比較，中、高劑量組小鼠的NK細胞活性差異均具有極顯著性意義(P<0.01)。說明該受試物可以增強小鼠的NK細胞活性。有研究表明給藥量為177.7 mg/kg純α-亞麻酸，可顯著提高小鼠NK細胞活性，本實驗中劑量組α-亞麻酸劑量為148.8 mg/kg ，實驗結果與文獻[7]結果一致，同時茶葉提取物也可以回升荷瘤小鼠NK細胞活性[9]。

3 結 論

體外細胞實驗結果表明，3種成分(茶葉提取物，苦瓜提取物和牡丹籽油)在體外均可以增強淋巴細胞增殖能力，相同質量濃度下茶葉提取物效果最好，苦瓜提取物次之，牡丹籽油最差；在復方軟膠囊所用的配方比例下，茶葉提取物效果最好，牡丹籽油次之，苦瓜提取物最差。細胞免疫功能檢測項目中的2個實驗(小鼠淋巴細胞轉化實驗和遲發型變態反應實驗)結果均為陽性，可判定細胞免疫功能測定結果陽性。體液免疫功能測定項目中，抗體生成細胞數檢測結果為陰性，可判定體液免疫功能測定結果為陰性。單核巨噬細胞功能測定項目中，小鼠碳廓清實驗結果為陽性，小鼠腹腔吞噬細胞吞噬熒光微球實驗結果為陰性，可判定單核巨噬細胞功能結果為陰性。NK細胞活性測定實驗中1個以上劑量組的結果呈陽性，可判定NK 細胞活性結果為陽性。在本實驗條件下細胞免疫功能和NK細胞活性結果為陽性，體液免疫功能和單核-巨噬細胞功能均為陰性，表明牡丹籽油復方軟膠囊具有增強免疫力功能。