脫膠葵花盤醇溶物提取工藝優化及抗氧化活性研究

包小蘭，袁興宇，李 歡，朝魯巴根，韓 博

(1.內蒙古農業大學 食品科學與工程學院，呼和浩特 010018； 2.內蒙古國際蒙醫醫院， 呼和浩特 010065)

油葵作為主要油料作物之一在我國被廣泛種植[1]。長期以來，秋收后的油葵除葵花籽用作榨油外其余成分均未被有效利用，如葵花盤幾乎被廢棄，當作牲畜飼料或垃圾焚燒，不僅污染環境還造成資源浪費[2-3]。葵花盤的利用近年來逐漸被重視，葵花盤富含一些活性物質如多糖、綠原酸、果膠、多酚、黃酮等[4]，對于其果膠及綠原酸的提取技術目前已較為成熟[5]，但對葵花盤中一些醇溶物如多糖、多酚、黃酮的研究不甚詳盡，其有效生物活性的開發更是少之甚少。現階段對于葵花盤中果膠的提取已經投入商業生產且初見規模，隨之廢棄的大量脫除果膠后的葵花盤渣，造成了巨大的浪費[6-8]。為此，本文以脫膠葵花盤渣為原料，探討脫膠葵花盤醇溶物提取工藝及抗氧化活性，為脫膠葵花盤的進一步開發利用提供參考，提高葵花籽工業副產品資源利用率和綜合經濟效益，為新型功能性食品開發應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

脫膠葵花盤渣，內蒙古康斯特生物科技有限公司；ABTS、DPPH，美國Sigma公司；氫氧化鈉、鹽酸、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、苯酚、無水碳酸鈉、福林酚試劑、三氯化鐵、三氯乙酸、硫酸亞鐵、水楊酸、過硫酸鉀，天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.1.2 儀器與設備

TDL-5-A型飛鴿牌系列離心機，LCJ-25C型冷凍干燥機，AL204型電子天平，PHSJ-4A型實驗室pH計，HJ-6型數顯恒溫磁力水浴鍋，HJ-1型磁力攪拌器，GZX-9140 MBE型數顯鼓風干燥箱，FS-150型超聲波處理器，UV-5500 PC 型紫外可見分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 脫膠葵花盤醇溶物的提取

將脫膠葵花盤渣用高速粉碎機粉碎，與蒸餾水混合均勻，4 000 r/min離心15 min收集沉淀，30℃烘干后粉碎過60目篩，得脫膠葵花盤粗粉。稱取該粗粉，按一定比例與一定體積分數的乙醇溶液混合，超聲波輔助處理一定時間后在一定溫度下攪拌浸提，浸提結束后4 000 r/min離心20 min，取上清液濃縮后真空冷凍干燥獲得醇提物，于密封袋4℃保存備用。以醇提物得率及其質量濃度為1 mg/mL時的DPPH自由基清除率為指標進行工藝優化。按下式計算醇提物得率。

醇提物得率=醇提物質量/脫膠葵花盤粗渣質量×100%

1.2.2 脫膠葵花盤醇提物抗氧化活性分析

1.2.2.1 DPPH 自由基清除率的測定[9]

取1 mL不同質量濃度的脫膠葵花盤醇提物溶液，依次加入1 mL DPPH溶液(0.1 mmol/L，95%乙醇配制)充分混勻，室溫避光靜置30 min，517 nm測定吸光值；用1 mL 95%乙醇溶液代替DPPH溶液為樣品參比組；空白組為1 mL的DPPH溶液與1 mL的95%乙醇溶液。DPPH自由基清除率根據下式進行計算。

DPPH自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

式中：Ai為樣品組吸光值；Aj為樣品參比組吸光值；A0為空白組吸光值。

1.2.2.2 羥自由基清除率的測定[10]

取1 mL不同質量濃度的脫膠葵花盤醇提物溶液，加入0.3 mL FeSO4、1 mL水楊酸、0.25 mL H2O2，混勻后37℃下水浴30 min，再加入0.45 mL蒸餾水離心，取上清液在510 nm處測吸光值。設置空白組。羥自由基清除率按下式計算。

羥自由基清除率=(A0-Ai)/A0×100%

式中：A0為空白組吸光值；Ai為樣品組吸光值。

1.2.2.3 ABTS自由基清除率的測定[11]

將5 mL 7.4 mmol/L的ABTS溶液與88 μL 2.6 mmol/L的過硫酸鉀混勻后室溫放置16 h，配制成ABTS工作液，室溫條件下波長734 nm處吸光值為0.70±0.02。0.2 mL ABTS工作液與10 μL不同質量濃度的脫膠葵花盤醇提物混合后靜置6 min，在734 nm處測定吸光值。ABTS自由基清除率按下式計算。

ABTS自由基清除率=(A0-Ai)/A0×100%

式中：A0為空白組吸光值；Ai為樣品組吸光值。

2 結果與分析

2.1 脫膠葵花盤醇溶物提取的單因素實驗

2.1.1 料液比對醇提物得率及其DPPH自由基清除率的影響

取脫膠葵花盤粗粉，分別以1∶8、1∶11、1∶14、1∶17、1∶20的料液比，加入體積分數為60%的乙醇溶液，攪拌均勻后超聲波處理15 min，50℃下恒溫攪拌提取1.0 h。測定醇提物得率及其DPPH自由基清除率，結果如圖1所示。

圖1 料液比對脫膠葵花盤醇提物得率及其DPPH自由基清除率的影響

由圖1可知，當料液比從1∶8增加到1∶17時，脫膠葵花盤醇提物得率和DPPH自由基清除率一直處于上升狀態，當料液比為1∶17時，脫膠葵花盤醇提物得率達到最大值(19.94%)，DPPH自由基清除率也達到最大值(69.27%)。但當料液比從1∶17增加到1∶20時，脫膠葵花盤醇提物得率及DPPH自由基清除率分別下降至18.11%和68.11%。在此反應體系中，料液比過高或過低都不利于醇溶物的提取。因此，脫膠葵花盤醇溶物提取的最適料液比為1∶17。

2.1.2 超聲波處理時間對醇提物得率及其DPPH自由基清除率的影響

取脫膠葵花盤粗粉，以1∶17的料液比加入體積分數為60%的乙醇溶液，攪拌均勻后超聲波分別處理15、30、45、60、75 min，50℃下恒溫攪拌提取1.0 h。測定醇提物得率及其DPPH自由基清除率，結果如圖2所示。

圖2 超聲波處理時間對脫膠葵花盤醇提物得率及其DPPH自由基清除率的影響

由圖2可知，當超聲波處理時間從15 min延長至30 min時，醇提物得率和DPPH自由基清除率均呈上升趨勢，當超聲波處理時間為30 min時，脫膠葵花盤醇提物得率達到最大值(17.21%)，同時，DPPH自由基清除率也達到最大值(70.91%)，當超聲波處理時間從30 min延長至75 min時，脫膠葵花盤醇提物得率及DPPH自由基清除率均呈下降趨勢。因此，脫膠葵花盤醇溶物提取的最適超聲波處理時間為30 min。

2.1.3 乙醇體積分數對醇提物得率及其DPPH自由基清除率的影響

取脫膠葵花盤粗粉，以1∶17的料液比加入體積分數分別為60%、65%、70%、75%、80%的乙醇溶液，攪拌均勻后超聲波處理30 min，50℃下恒溫攪拌提取1.0 h。測定醇提物得率及其DPPH自由基清除率，結果如圖3所示。

由圖3可知，當乙醇體積分數從60%增加到70%時，醇提物得率從10.88%上升到15.31%，DPPH自由基清除率從62.49%上升到70.57%，當乙醇體積分數從70%增加到80%時，醇提物得率及DPPH自由基清除率均下降。因此，脫膠葵花盤醇溶物提取的最適乙醇體積分數為70%。

圖3 乙醇體積分數對脫膠葵花盤醇提物得率及其DPPH自由基清除率的影響

2.1.4 浸提溫度對醇提物得率及其DPPH自由基清除率的影響

取脫膠葵花盤粗粉，以1∶17的料液比加入體積分數為70%的乙醇溶液，攪拌均勻后超聲波處理30 min，分別在20、35、50、65、80℃下恒溫攪拌提取1.0 h。測定醇提物得率及其DPPH自由基清除率，結果如圖4所示。

圖4 浸提溫度對脫膠葵花盤醇提物得率及其DPPH自由基清除率的影響

由圖4可知，當浸提溫度從20℃升至50℃時，醇提物得率及DPPH自由基清除率均處于上升趨勢，醇提物得率從11.87%上升到18.23%，DPPH自由基清除率從65.44%上升到70.92%。當浸提溫度從50℃升至80℃時，醇提物得率及DPPH自由基清除率均呈下降趨勢。因此，脫膠葵花盤醇溶物提取的最適浸提溫度為50℃。

2.1.5 浸提時間對醇提物得率及其DPPH自由基清除率的影響

取脫膠葵花盤粗粉，以1∶17的料液比加入體積分數為70%的乙醇溶液，攪拌均勻后超聲波處理30 min，50℃下分別恒溫攪拌提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h。測定醇提物得率及其DPPH自由基清除率，結果如圖5所示。

由圖5可知，當浸提時間從0.5 h延長至1.0 h時，醇提物得率及DPPH自由基清除率均處于上升趨勢，醇提物得率從13.01%上升到16.19%，DPPH自由基清除率從64.62%上升到69.13%。當浸提時間從1.0 h延長到2.5 h時，醇提物得率及DPPH自由基清除率均呈現緩慢下降的趨勢。因此，脫膠葵花盤醇溶物提取的最適浸提時間為1.0 h。

圖5 浸提時間對脫膠葵花盤醇提物得率及其DPPH自由基清除率的影響

2.2 脫膠葵花盤醇溶物提取的正交實驗

按照單因素實驗結果，選擇浸提溫度(A)、浸提時間(B)、超聲波處理時間(C)、料液比(D)、乙醇體積分數(E)進行五因素四水平正交實驗，確定醇溶物最佳提取工藝。正交實驗因素水平見表1，正交實驗結果與分析見表2。

表1 正交實驗因素水平

表2 正交實驗結果與分析

續表2

實驗號ABCDE得率/%DPPH自由基清除率/%DPPH自由基清除率k164.0064.2666.0765.3665.63k265.6169.0968.3567.3866.72k365.7665.6762.7265.1466.55k468.9465.2867.1666.4365.41R4.944.835.632.241.31

由表2可知，5個因素對醇提物得率的影響程度順序為浸提溫度>浸提時間>超聲波處理時間>乙醇體積分數>料液比，最佳組合是A4B2C2D2E2，5個因素對醇提物的DPPH自由基清除率的影響程度順序為超聲波處理時間>浸提溫度>浸提時間>料液比>乙醇體積分數，最佳組合是A4B2C2D2E2，與醇提物得率的最佳提取工藝條件一致。即本實驗醇溶物的最佳提取工藝條件為浸提溫度60℃、超聲波處理時間30 min、料液比1∶17、乙醇體積分數70%、浸提時間1.0 h，經驗證，在此工藝條件下脫膠葵花盤醇提物得率達到20.32%，DPPH自由基清除率達到72.13%。

2.3 脫膠葵花盤醇提物的抗氧化活性

2.3.1 脫膠葵花盤醇提物質量濃度對DPPH自由基清除率的影響

DPPH自由基是一種以氮為中心的穩定自由基，常被用來評價抗氧化劑對自由基的清除能力，對DPPH自由基的清除效果可反映抗氧化劑的供氫能力[12-13]。分析了脫膠葵花盤醇提物的DPPH自由基清除率，結果如圖6所示。

圖6 脫膠葵花盤醇提物的DPPH自由基清除率

由圖6可知，隨著質量濃度的升高，脫膠葵花盤醇提物DPPH自由基清除率呈上升趨勢，但低于相同質量濃度VC的DPPH自由基清除率。VC對DPPH 自由基的清除能力始終保持在較高水平。當質量濃度為0.8 mg/mL時，脫膠葵花盤醇提物的DPPH自由基清除率為50.03%，VC的DPPH自由基清除率為90.69%；當質量濃度為1.6 mg/mL時，脫膠葵花盤醇提物的DPPH自由基清除率為81.02%，VC的DPPH自由基清除率為95.82%，兩者的差距明顯縮小。可見隨著質量濃度的升高，脫膠葵花盤醇提物的DPPH自由基清除率逐漸接近VC。

2.3.2 脫膠葵花盤醇提物質量濃度對羥自由基清除率的影響

羥自由基可通過細胞膜與脂質、DNA以及蛋白質等生物大分子對組織造成損傷，或引起氧化損傷[14]。脫膠葵花盤醇提物的羥自由基清除率如圖7所示。

圖7 脫膠葵花盤醇提物的羥自由基清除率

由圖7可知，脫膠葵花盤醇提物對羥自由基有一定的清除作用，但清除能力低于VC。當質量濃度為0.8 mg/mL時，脫膠葵花盤醇提物的羥自由基清除率為25.52%，VC的羥自由基清除率為79.68%；當質量濃度為1.4 mg/mL時，脫膠葵花盤醇提物的羥自由基清除率為48.22%；當質量濃度為1.6 mg/mL時，脫膠葵花盤醇提物的羥自由基清除率為49.58%，VC的羥自由基清除率為97.69%，表明質量濃度為1.4 mg/mL時，脫膠葵花盤醇提物羥自由基清除率已經達到較高值，繼續提高質量濃度，羥自由基清除率變化無顯著性差異。說明前期醇提物質量濃度對羥自由基清除率影響呈現劑量依賴性。

2.3.3 脫膠葵花盤醇提物質量濃度對ABTS自由基清除率的影響

ABTS在氧化劑的作用下會形成藍綠色的單陽離子自由基[15]，當有抗氧化劑存在時，該自由基的形成會受到抑制，顏色變淺，吸光值減小[16]。脫膠葵花盤醇提物的ABTS自由基清除率如圖8所示。

圖8 脫膠葵花盤醇提物的ABTS自由基清除率

由圖8可知，脫膠葵花盤醇提物具有一定的ABTS自由基清除活力，但相比VC較低。當脫膠葵花盤醇提物質量濃度為0.8 mg/mL時，其ABTS自由基清除率為28.95%，隨著質量濃度的增大，脫膠葵花盤醇提物的ABTS自由基清除能力增加，當脫膠葵花盤醇提物質量濃度達到1.6 mg/mL時，其ABTS自由基清除率為49.92%，呈劑量依賴性。

3 結 論

通過單因素實驗和正交實驗得到脫膠葵花盤醇溶物的最佳提取工藝條件為：料液比1∶ 17，超聲波處理時間30 min，乙醇體積分數70%，浸提溫度60℃，浸提時間1.0 h。在最佳工藝條件下，脫膠葵花盤醇提物得率達到20.32%，DPPH自由基清除率達到72.13%。脫膠葵花盤醇提物對DPPH自由基、羥自由基、ABTS自由基均具有一定的清除能力。脫膠葵花盤醇提物隨質量濃度的增大，DPPH自由基清除率越接近VC，羥自由基清除率及ABTS自由基清除率低于VC，不同自由基清除率與醇提物質量濃度均呈現一定劑量依賴性。以上結果表明脫膠葵花盤醇提物具有較好的抗氧化活性。