測定菜籽油中酚類化合物樣品前處理方法的比較

宋軍鴿，曹 晨，李進偉，徐勇將，劉元法

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122)

酚類化合物在植物體內廣泛存在，其在油菜籽中的含量較高，主要包括酚酸和單寧[1]。油菜籽在制油過程中，會有部分酚類化合物轉移至油中，從而改善菜籽油的抗氧化性能和營養品質。劉陽等[2]對7種食用植物油中的微量活性成分進行了比較，發現菜籽油的總酚含量最高，約為139.83 mg/kg。研究表明，酚類化合物具有抗氧化、抗菌、抗癌、降血脂、防治心血管疾病等生理功能，對人體健康有益[3-5]。

傳統的植物油中酚類化合物的提取方法主要為液液萃取(LLE)[6]和固相萃取(SPE)。Yang等[7]采用LLE對經微波預處理的油菜籽制備的菜籽油中的酚類化合物進行提取，采用80%的甲醇作為提取溶劑，反復提取3次，并結合超高效液相色譜(UPLC)考察了不同微波預處理時間對菜籽油中酚類化合物的影響。但LLE需要劇烈振蕩，常會出現乳化現象，同時通常需要重復提取以盡可能提取目標物，消耗大量有機溶劑，造成環境污染。SPE利用選擇性吸附與選擇性洗脫的液相色譜法分離原理，實現對目標物的分離純化[8]。Rekas等[9]使用SPE提取菜籽油中的酚類化合物，將菜籽油樣品通過二醇基(Diol)萃取柱，然后分別使用正己烷和正己烷- 乙酸乙酯(體積比90∶10)進行淋洗，最后用甲醇進行洗脫，研究微波預處理油菜籽制備的菜籽油在儲存過程中其所含酚類化合物的變化規律。雖然相比于LLE，SPE更具有選擇性，且可同時實現對目標物的富集與純化，但是SPE小柱價格昂貴，成本較高。

QuEChERS前處理方法是近年來發展起來的一種快速樣品前處理技術，通常包括萃取和凈化兩部分。萃取一般采用溶劑萃取的方法，乙腈是最常用的有機溶劑。凈化采用分散固相萃取的方法，即向上述所得含目標物的萃取液中加入特定的吸附劑除去雜質，以降低后續分析時雜質對目標物的干擾[10]。QuEChERS前處理方法最初被應用于高水分含量的水果和蔬菜中農藥殘留的分析，因其具有簡便、高效、有機溶劑消耗少、基質共提物含量低等優勢，應用范圍日益廣泛，被逐漸用于獸藥、真菌毒素、多環芳烴、色素等多種化合物分析[11-12]。本文采用LLE、SPE、QuEChERS 3種不同前處理方法提取菜籽油中的酚類化合物，并采用LC-MS/MS技術分析比較了3種不同前處理方法對菜籽油酚類化合物提取效果的影響。其中，利用QuEChERS前處理方法提取菜籽油中的酚類化合物尚屬國內外首次。本研究可為菜籽油中酚類化合物的組成和含量分析提供技術支撐，從而為菜籽油氧化穩定性與營養品質的研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

甘藍型油菜籽，購于中國農業科學院油料作物研究所。無水硫酸鎂、氯化鈉、乙酸、正己烷、乙酸乙酯，均為分析純；甲醇、乙腈為色譜純，德國Merck公司；芥子堿標準品，大連美侖生物技術有限公司；咖啡酸、丁香酸、阿魏酸標準品，國藥化學試劑集團；對香豆酸標準品，美國Fisher公司；芥子酸、白藜蘆醇標準品，上海源葉生物技術有限公司；Canolol標準品，烏克蘭Enamine公司；十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18，50 μm)，天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.1.2 儀器與設備

Waters ACQUITY高效液相色譜儀、Waters Xevo三重四級桿串聯質譜儀，美國Waters公司；5804R型高速離心機，德國Eppendorf公司；Sorvall LYNX 4000高速落地離心機，美國Thermo公司；紅外干燥箱；二醇基固相萃取(Diol-SPE)小柱(200 mg，3 mL)，上海安譜實驗科技股份公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菜籽油的制備

取適量油菜籽平整鋪于托盤(料層厚度約5 mm)，將其置于紅外干燥箱中同一位置，在120℃條件下加熱30 min后取出，冷卻至室溫。取預處理后的油菜籽1.2 kg，置于液壓榨油機中進行壓榨，壓榨時間30 min，壓榨溫度25℃，榨機壓力60 MPa。收集油樣，在5 000 r/min條件下離心10 min，去除雜質得菜籽油樣品，置于4℃冰箱冷藏備用。

1.2.2 標準曲線的繪制

準確稱取7種酚類化合物標準品各25.0 mg，分別溶解于25 mL甲醇，配制成質量濃度為1 mg/mL的標準儲備液，并用錫紙包裹置于-20℃冰箱中保存備用。取一定體積的標準儲備液，用甲醇逐級稀釋，配制不同質量濃度的混合標準溶液，現配現用。以目標化合物的質量濃度為橫坐標，目標化合物與內標物(白藜蘆醇)的峰面積比值為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.3 樣品前處理

LLE：準確稱取2.50 g菜籽油樣品溶于3 mL正己烷中，分別用甲醇溶液提取3次，每次振搖一段時間，樣品在4 000 r/min條件下離心5 min，合并3次甲醇提取液。將提取液用氮吹儀吹干，加入2.5 mL甲醇回溶，經0.22 μm濾膜過濾后置于樣品瓶中用于LC-MS/MS分析。

SPE：將Diol-SPE小柱置于固相萃取裝置中，分別用5 mL甲醇和5 mL正己烷活化。準確稱取1.50 g菜籽油樣品溶于5 mL正己烷，振搖1 min后裝柱，然后分別用5 mL正己烷和5 mL正己烷-乙酸乙酯(體積比90∶10)洗柱，最后洗脫，收集洗脫液，用氮吹儀吹干，加入1.5 mL甲醇回溶，經0.22 μm濾膜過濾后置于樣品瓶中用于LC-MS/MS分析。

QuEChERS：參考Song等[13]的方法。準確稱取6.00 g菜籽油樣品加入到50 mL離心管中，分別加入3 mL水和18 mL乙腈，振搖5 min。隨后，加入7.20 g無水硫酸鎂和1.80 g氯化鈉，振搖2 min。樣品在4 000 r/min條件下離心5 min，將上清液轉移至玻璃試管中，置于-20℃冰箱中冷凍2 h后取出。移取9 mL上清液于另一15 mL離心管中，加入270 mg C18和1.80 g無水硫酸鎂，振搖2 min后在4 000 r/min條件下離心5 min。移取4.5 mL上清液用氮吹儀吹干，加入1.5 mL甲醇回溶，經0.22 μm濾膜過濾后置于樣品瓶中用于LC-MS/MS分析。

1.2.4 基質共提物含量測定

將3種不同前處理方法所得的提取液轉移至已知質量(m0)的離心管中，用氮吹儀吹干，測定總質量(m1)，按下式計算基質共提物含量。

基質共提物含量=(m1-m0)/樣品質量

1.2.5 LC-MS/MS分析

色譜條件：Hypersil GOLD C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm，美國Thermo公司)；流動相A為水，流動相B為乙腈，二者均添加0.1%乙酸；梯度洗脫條件為0～0.5 min 10% B，0.5～15 min 10%～55% B，15～15.5 min，55%～100% B，15.5～17 min 100% B，17～17.5 min 100%～10% B，17.5～20 min 10% B；進樣量2 μL；流速0.3 mL/min；柱溫35℃。

質譜條件：電噴霧離子源(ESI)，多反應監測模式(MRM)，其中芥子堿和Canolol為正離子掃描模式，其他酚類化合物為負離子掃描模式；毛細管電壓3 kV，離子源溫度110℃，脫溶劑溫度400℃，脫溶劑氣和錐孔氣均為N2，脫溶劑氣流速600 L/h，錐孔氣流速50 L/h。

1.2.6 數據處理

使用MassLynx軟件(版本4.1)對LC-MS/MS數據進行分析。采用Origin 8.5作圖。

2 結果與討論

2.1 標準曲線

按照1.2.5所述LC-MS/MS方法對不同質量濃度的酚類化合物標準溶液進行測定，每個質量濃度平行測定3次，酚類化合物標準曲線回歸方程、R2和線性范圍見表1。

表1 酚類化合物標準曲線回歸方程、R2和線性范圍

2.2 LLE條件的優化

為了得到較好的提取效果，采用加標量為10 μg/g的菜籽油樣品對實驗中的幾個重要實驗參數進行優化。每種處理均測定3個平行樣品，結果以“平均回收率±相對標準偏差”表示。

2.2.1 提取溶劑的體積分數

酚類化合物大多具有較強的極性，且具有一定的水溶性，因此一般采用有機溶劑與水的混合溶劑對其進行提取，而甲醇為最常用的酚類化合物提取的有機溶劑，因此本研究分別選取體積分數為60%、70%、80%、90%、100%的甲醇作為提取溶劑進行比較研究，結果見圖1。

圖1 甲醇體積分數對回收率的影響

由圖1可知：當甲醇體積分數在60%～80%時，隨著甲醇體積分數的增加，酚類化合物回收率明顯增加；當甲醇體積分數大于80%時，酚類化合物回收率逐漸下降。因此，本實驗選擇體積分數為80%的甲醇作為提取溶劑。

2.2.2 提取溶劑的用量

分別選擇每次用2、3、4、5 mL體積分數為80%的甲醇溶液提取菜籽油中的酚類化合物，結果見圖2。

圖2 提取溶劑用量對回收率的影響

由圖2可知：當提取溶劑用量為2 mL時，酚類化合物的回收率較低，說明2 mL溶劑不足以使酚類化合物提取完全；提取溶劑用量增加至3 mL時，酚類化合物的回收率迅速增加；繼續增加提取溶劑用量，回收率基本保持不變。說明3 mL溶劑足以將菜籽油中的酚類化合物提取完全，繼續增加溶劑用量反而會造成溶劑的浪費。因此，在后續的實驗中每次提取溶劑用量均設定為3 mL。

2.2.3 振搖時間

考察了振搖時間對菜籽油中酚類化合物提取效果的影響，結果見圖3。

圖3 振搖時間對回收率的影響

由圖3可知：當振搖時間在3～5 min時，隨著振搖時間的延長，酚類化合物回收率迅速上升；當振搖時間超過5 min時，回收率無明顯變化。為了節省實驗時間，提高操作效率，綜合考慮，選擇振搖時間為5 min。

2.3 SPE條件優化

采用加標量為10 μg/g的菜籽油樣品對實驗中的幾個重要實驗參數進行了優化。每種處理均測定3個平行樣品，結果以“平均回收率±相對標準偏差”表示。

2.3.1 洗脫劑的種類

酚類化合物一般為極性化合物，因此本研究分析比較了極性較強的乙腈和甲醇作為洗脫劑對目標物的洗脫效果，結果見圖4。

圖4 洗脫劑種類對回收率的影響

由圖4可知，對于咖啡酸、芥子堿和Canolol，甲醇的洗脫效果優于乙腈，對于其他酚類化合物，兩種溶劑洗脫能力相差不大。綜合考慮，選擇甲醇作為洗脫劑。

2.3.2 洗脫劑用量

本研究分別選擇3、4、5、6、7 mL的甲醇對目標物進行洗脫，結果見圖5。

圖5 洗脫劑用量對回收率的影響

由圖5可知，當洗脫劑用量從3 mL增加至5 mL時，酚類化合物的回收率逐漸增加，當洗脫劑用量超過5 mL時，回收率并沒有明顯增加，說明繼續增加洗脫劑用量并不會提高酚類化合物的回收率，反而會增大有機溶劑的排放量。因此，本研究選擇洗脫劑用量為5 mL。

2.4 3種不同前處理方法的比較

2.4.1 回收率

向空白菜籽油樣品中加入7種酚類化合物標準品，加標量為10 μg/g，分別用1.2.3中所述3種不同前處理方法處理空白樣品和加標樣品，按照1.2.5中所述LC-MS/MS方法對樣品進行分析。每種處理均測定3個平行樣品，結果以“平均回收率±相對標準偏差”表示，結果見表2。

表2 不同前處理方法對菜籽油中酚類化合物的回收率 %

由表2可見，QuEChERS方法對7種酚類化合物的回收率為85.16%～101.78%，相對標準偏差為1.21%～6.04%，明顯優于LLE和SPE。SPE的回收率為56.98%～83.79%，相對標準偏差為4.81%～9.23%，對于咖啡酸的回收率僅為56.98%，低于QuEChERS和LLE，提取效果最不理想。這可能是SPE需要采用合適的溶劑對樣品進行淋洗，在洗去雜質的同時也洗去了部分酚類化合物；另一方面，在用甲醇洗脫目標物的過程中，由于流速較快，酚類化合物與甲醇作用時間較短，因而沒有被完全收集，使得回收率較低。而LLE和QuEChERS由于提取溶劑可以與目標物充分接觸，因而回收率較高。

2.4.2 基質共提物含量

植物油是一種復雜的基質，在對酚類化合物進行提取的過程中會同時伴隨著脂肪等基質共提物，從而對后續目標物的分析產生干擾，同時也會對色譜柱造成污染，縮短色譜柱的使用壽命。本研究比較了LLE、SPE和QuEChERS 3種不同前處理方法對菜籽油酚類化合物進行提取時基質共提物的含量，結果見表3。

表3 不同前處理方法對基質共提物含量的影響mg/g

由表3可知，QuEChERS方法的基質共提物含量最低，為2.04 mg/g，LLE的基質共提物含量最高，為6.80 mg/g。這可能是因為QuEChERS方法在傳統LLE的基礎上，通過低溫冷凍使脂肪等雜質凝固析出[14]，同時C18吸附劑除去了脂肪等非極性干擾物[15]，大大降低了基質共提物的含量。

3 結 論

通過LC-MS/MS分析比較了LLE、SPE、QuEChERS 3種不同前處理方法對菜籽油中酚類化合物的提取效果。結果表明：相比于LLE和SPE，QuEChERS前處理方法的提取效果最好，對菜籽油中7種酚類化合物的回收率可達85.16%～101.78%，基質共提物含量最低，為2.04 mg/g；LLE的回收率為66.04%～101.11%，基質共提物含量最高，為6.80 mg/g；SPE的回收率最低，僅為56.98%～83.79%，基質共提物含量為2.30 mg/g。本研究證明QuEChERS方法是一種操作簡便、安全可靠、準確度高的樣品前處理技術，適合于菜籽油中酚類化合物的提取。