紫外輻射對小球藻光合性能及油脂積累的影響

孫小琴，孫 昕，李鵬飛，劉興社，成智文，李 青

(1.西安建筑科技大學 陜西省環境工程重點實驗室,教育部西北水資源和環境生態重點實驗室，西安 710055； 2.咸陽陶瓷研究設計院有限公司，陜西 咸陽 712000)

隨著化石能源的日益枯竭和人們對環境保護的不斷重視，生物柴油作為新型的清潔能源，受到廣泛關注[1-2]。小球藻油脂含量較高，生長速度快，是一種理想的能源微藻[3-4]。高昂的生產成本是微藻產業化生產的一大阻礙，而提高油脂產量是有效的解決途徑之一[5]。有研究表明，脅迫生長可誘導微藻以中性脂質或多糖的形式積累能量[6]，而紫外線脅迫被視為是一種良好的處理方式，其操作簡單、突變率高，尤其在高脂微藻的培育中具有污染少、輻射劑量改變靈活、誘導快速等優點[7-8]。葉麗等[9]用紫外線輻射三角褐指藻，得到總脂含量高達36.66%的突變藻株；Liu等[10]利用紫外線輻射小球藻，突變藻株的油脂含量增加了21.97%。然而在紫外誘變育種中，優良性狀藻株的篩選過程耗時長，篩選后的藻株存在不穩定性，這對能源微藻的產業化生產造成一定的阻礙，如能省去復雜的篩選程序，利用紫外線直接對藻液進行輻射，既可提高微藻的油脂產量，又能縮短培育時間，將明顯發揮紫外誘變的優勢，但目前大多研究仍停留在利用誘變篩選突變株這一層次上。本文創新利用紫外誘變的優勢，避免了長時間的篩選過程，以期突破微藻產業化的瓶頸。

本文采用紫外線直接對小球藻藻液進行輻射，通過測定不同紫外輻射劑量下小球藻的生物量、葉綠素熒光參數、油脂含量以及脂肪酸組成及含量，確定最佳紫外輻射劑量，并利用熒光定量PCR檢測與油脂合成相關基因的表達情況，分析紫外輻射促進微藻產油的可能生化途徑，以期為高產油微藻的培育提供理論基礎，為微藻的產業化生產提供應用依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

小球藻，購于中國科學院武漢水生生物研究所淡水藻種庫。BG11培養基，主要成分如下：(NH4)3C6H5O7，0.006 g/L；C6H7O8，0.006 g/L；EDTA-MgNa2，0.001 g/L；NaNO3，1.5 g/L；K2HPO4，0.039 g/L；MgSO4·7H2O，0.075 g/L；CaCl2·2H2O，0.036 g/L；Na2CO3，0.02 g/L；H3BO4，2.86 mg/L；MnCl2·4H2O，1.81 mg/L；ZnSO4·7H2O，0.222 mg/L；NaMoO4·2H2O，0.391 mg/L；CuSO4·5H2O，0.079 mg/L；Co(NO3)·6H2O，0.049 mg/L。

光照培養箱，SW-CJ-1D凈化工作臺，UVC-254型紫外輻照度計，UV2600型紫外可見分光光度計，真空冷凍干燥機，M系列IMAGING-PAM調制葉綠素熒光成像系統，7890A/7000B型氣相色譜質譜聯用儀，CFX96TM實時定量PCR儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 小球藻的培養

采用BG11培養基接種小球藻獲得小球藻藻液。

將裝有小球藻藻液的500 mL三角錐形瓶，用無菌膜封閉瓶口，置于恒溫光照培養箱中，在平均光照強度70.7 μmol/(m·s)、光照周期12L/12D、培養溫度(25±1)℃條件下，采用半連續培養模式培養。每天隨機調換錐形瓶的位置并搖動3～4次，定時取樣進行分析。

1.2.2 紫外輻射誘變

實驗用紫外燈管功率20 W，發射波長254 nm，實驗前將紫外燈打開照射30 min以穩定光強并殺菌。取200 mL小球藻藻液于18 cm玻璃培養皿中，置于磁力攪拌器上，保證紫外線能均勻輻射藻液。通過改變紫外輻射時間設置5個輻射劑量梯度(0、20、40、60、80 mJ/cm2)，每個梯度設2個平行樣。藻液經紫外輻射后用錫紙包裹培養皿置于恒溫光照培養箱中避光培養24 h避免“光復活”[11]，再轉移至500 mL三角錐形瓶中按1.2.1條件繼續進行培養。

本實驗中藻液與紫外燈的垂直距離為30 cm，通過紫外輻照度計測量培養皿圓心處和圓周4個切點處藻液表面處的紫外輻射強度，得到平均輻射強度(I)為0.27 mW/cm2，根據下式[12]計算輻射時間。

D=I×t

式中：D為輻射劑量，mJ/cm2；t為輻射時間，s。

1.2.3 生物量的測定

光密度法：取一定量的藻液于1 cm石英比色皿中，采用紫外可見分光光度計測定680 nm處的吸光度(OD)。

稱重法：將藻液在10 000 r/min、4℃下離心10 min，并用蒸餾水洗滌2～3次，除去原培養基中的代謝產物等雜質，再用冷凍干燥機獲得干燥藻粉，稱取藻粉質量。

1.2.4 葉綠素熒光參數的測定

采用調制葉綠素熒光成像系統測定小球藻的葉綠素熒光參數Fv/Fm、Y(Ⅱ)，檢測前將藻液暗適應5 min。

1.2.5 油脂含量的測定

采用改進的Bligh-Dyer法[13]測定油脂含量。取10 mg凍干的藻粉，加入1.6 mL蒸餾水、4 mL甲醇、2 mL氯仿，用渦旋振蕩器將混合液混勻振蕩2 min，超聲破碎5 min，再加入2 mL氯仿繼續渦旋振蕩1 min，加入2 mL蒸餾水渦旋振蕩1 min，使最終的氯仿、甲醇、蒸餾水體積比為1∶1∶0.9，再次離心，靜置分層，取下層氯仿相，再向原管中加入氯仿繼續萃取1次，合并氯仿相并在氮氣下吹脫，得到小球藻油，稱重計算小球藻油脂含量。

1.2.6 熒光定量PCR的測定

本次測定的目的基因是accD、gapA、Me、Pk。gapA是GADPH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)的編碼基因，GADPH是Calvin循環的重要參與酶，與碳代謝有密切聯系。accD是ACCase(乙酰輔酶A羧化酶)的編碼基因，在自養條件下，其轉錄量與油脂積累量呈正相關[11]。Me是ME(蘋果酸酶)的編碼基因，ME可將蘋果酸催化為丙酮酸鹽，并產生NADPH(還原型輔酶Ⅱ)，NADPH可以作為還原力和能量，對脂肪酸的生物合成過程是必要的。Pk是PK(丙酮酸激酶)的編碼基因，PK活性降低時，糖酵解途徑受阻，對油脂的積累產生一定的影響[13]。

具體測定按如下流程進行操作：①用Trizol法提取總RNA。②反轉錄。反轉錄體系見表1，添加試劑成分見表2。③引物設計。設計內參基因18SRNA和目的基因的引物[14]，如表3所示。④熒光定量PCR。按表4配制qPCR反應體系，將樣品放入CFX96TM實時定量PCR儀中檢測，設置檢測參數為95℃預變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，循環54次。

表1 反轉錄體系

表2 添加試劑成分

表3 內參基因和目的基因的引物序列

表4 qPCR反應體系

1.2.7 小球藻油脂肪酸組成分析

將抽提的小球藻油用NaOH-CH3OH溶液皂化，加入30%的二氧化碳乙醚絡合物甲醇溶液進行酯化，再加入2 mL正己烷振蕩5 min，靜置后取上層的正己烷液上機分析[15]。用氣相色譜質譜聯用儀測定脂肪酸的組成和含量。GC條件：DB-23石英毛細管色譜柱(60 m×0.25 mm×250 μm)；進樣量1 μL；分流比50∶1；進樣口溫度210℃；氦氣流速1 mL/min；升溫程序為80℃保持5 min，以4℃/min的速度升到290℃，并在290℃條件下保持5 min。MS條件：電子能量70 eV；四極桿溫度150℃；離子源溫度250℃；溶劑延遲2 min。質譜圖利用NIST標準譜庫進行檢索，采用面積歸一化法定量。

2 結果與分析

2.1 不同紫外輻射劑量下的小球藻藻液的吸光度

圖1為不同紫外輻射劑量下小球藻藻液吸光度隨培養時間的變化情況。

圖1 不同紫外輻射劑量下小球藻藻液吸光度隨培養時間的變化

由圖1可見，經過紫外輻射后，小球藻的生長受到了不同程度的抑制，輻射劑量越大，抑制作用越強。20、40 mJ/cm2劑量對小球藻的抑制作用較弱，2 d后小球藻即可恢復生長，生長速度與對照組(紫外輻射劑量為0 mJ/cm2，下同)基本一致。60、80 mJ/cm2劑量對小球藻的抑制作用較強，需經4 d恢復生長，生長速度慢于對照組。從22 d開始，小球藻的生長速度變慢，進入穩定期，劑量為20、40 mJ/cm2的小球藻吸光度與對照組的基本相等，劑量為60、80 mJ/cm2的小球藻吸光度明顯低于對照組的。Liu等[10]用紫外誘變小球藻，突變藻株的生物量比原始藻株提高了7.6%。說明在適宜的紫外輻射條件下，微藻的生長并不會受到抑制。

2.2 不同紫外輻射劑量下小球藻的葉綠素熒光參數

2.2.1Fv/Fm

Fv/Fm反映植物潛在的最大光合作用能力。不同紫外輻射劑量下小球藻的Fv/Fm隨培養時間的變化情況見圖2。

圖2 不同紫外輻射劑量下小球藻Fv/Fm隨培養時間的變化

由圖2可見，紫外輻射劑量越大，小球藻的Fv/Fm值越低，說明紫外輻射使小球藻的光合作用能力降低，降低程度隨紫外輻射劑量增大而增強。不同紫外輻射劑量下的Fv/Fm在一定培養時間內會恢復到相對穩定值，劑量越大，恢復時間越長，最終的穩定值越低。這可能是小球藻的光系統啟動了各種熱耗散形式的光保護途徑，受損的光系統逐漸修復，但修復能力隨紫外輻射劑量的增加而削弱。20、40 mJ/cm2劑量下的最高Fv/Fm值分別為0.593、0.588，與對照組的相當，表明其光合性能良好。而60、80 mJ/cm2劑量下的Fv/Fm值較對照組的低，說明其光合性能變差。

2.2.2Y(Ⅱ)

Y(Ⅱ)表征光系統的實際光能捕獲效率，是植物光合能力的重要衡量指標[16]。不同紫外輻射劑量下小球藻的Y(Ⅱ)隨培養時間的變化情況見圖3。

圖3 不同紫外輻射劑量下小球藻Y(Ⅱ)隨培養時間的變化

由圖3可見，在3～5 d，不同紫外輻射劑量下小球藻的Y(Ⅱ)不同程度地降低，劑量越大，Y(Ⅱ)值越低，說明光系統PSⅡ因紫外輻射而受到損傷，光能轉化效率降低，且PSⅡ的損傷程度隨紫外輻射劑量的增加而增大。PSⅡ的損傷可能表現在兩方面：一是光合器官受到損傷，光系統中的捕光色素蛋白復合體自身解體甚至失去捕光功能[17]；二是紫外線導致PSⅡ核心復合體的反應中心D1蛋白甚至D2蛋白受損，為避免這種損傷，藻類會相應地提高D1蛋白的周轉速度以促進自我修復[18]。因此，在5～11 d，Y(Ⅱ)逐漸升高，不同劑量間的差異縮小。在11～23 d，Y(Ⅱ)基本達到穩定，23 d開始，小球藻進入生長后期，光化學反應不如對數生長期活躍，Y(Ⅱ)逐漸降低。與Fv/Fm 的變化特性類似，劑量低于40 mJ/cm2下的Y(Ⅱ)最終穩定在較高值，20、40 mJ/cm2劑量下的Y(Ⅱ)最高值分別為0.598、0.594，與對照組的相當，表明光系統的光能捕獲效率高；劑量高于40 mJ/cm2下的Y(Ⅱ)則相反。

2.3 不同紫外輻射劑量下小球藻的干重與產油情況

對不同紫外輻射劑量下的小球藻培養28 d，測定其干重和產油情況，結果見圖4、圖5。

圖4 不同紫外輻射劑量下小球藻的干重與油脂含量

圖5 不同紫外輻射劑量下小球藻的油脂產量

由圖4可見，20、40 mJ/cm2劑量下小球藻的干重分別為530、515 mg/L，與對照組相差不大，其他劑量下的干重則小于對照組。20、40 mJ/cm2劑量下的油脂含量均有提升，其中40 mJ/cm2劑量下的油脂含量最高，為46%，比對照組提高了39.40%，之后隨著紫外輻射劑量的增大，小球藻的油脂含量下降。由圖5可見，與對照組相比，20～40 mJ/cm2劑量下的油脂產量均有提高，其中40 mJ/cm2劑量下油脂產量最高，達237 mg/L，比對照組提高了39.22%，之后隨著紫外輻射劑量的增大，小球藻的油脂產量下降。Sharma等[19]利用適宜的輻射劑量對小球藻進行紫外誘變，得到突變藻株的總脂含量幾乎加倍。這些研究結果說明適宜的紫外輻射可在一定程度上提高微藻的產油能力，可能是紫外線輻射導致小球藻內與油脂代謝相關的基因或其調控序列發生突變，基因產物的活性發生變化，從而引起油脂含量的變化[20]。

2.4 不同紫外輻射劑量下小球藻的熒光定量PCR結果

圖6顯示了不同紫外輻射劑量下小球藻目的基因的相對表達情況(以對照組的基因表達量為標準)。

圖6 不同紫外輻射劑量下小球藻目的基因的相對表達量

由圖6可見：各輻射劑量下accD、gapA的相對表達量均提高，其中40 mJ/cm2劑量的提升幅度最大，分別提高了約2.5倍和5倍；除了80 mJ/cm2劑量下Me的相對表達量降低，40 mJ/cm2劑量下Me的相對表達量基本變化不大外，其他劑量下的Me相對表達量均提高，其中60 mJ/cm2劑量的提升幅度最大，提高了約1倍；除40 mJ/cm2劑量下Pk的相對表達量未降低外，其他劑量下Pk的相對表達量均有較大幅度的降低。理論而言，小球藻的油脂積累可能與ACCase有關，ACCase所催化的反應是脂肪酸合成的第一步，在脂肪酸的合成與代謝中發揮重要作用[21]，accD表達量的提高會促進藻體內脂肪酸的合成。Calvin循環為自養藻類提供合成油脂的碳源，相關酶的作用可能與油脂積累密切相關，GAPDH是Calvin循環的作用酶之一，gapA表達量的提高會促進更多碳源流向油脂合成。與Calvin循環密切相關的戊酮磷酸途徑，可產生大量NADPH，為油脂合成提供能量，所以Me表達量的提高可能使小球藻的油脂合成具備更多的能量，有研究表明Me與脂質積累量顯著相關，其表達情況會影響脂質的積累[22]。PK是將磷酸烯醇式丙酮酸轉化為丙酮酸的酶，丙酮酸的一部分進行發酵產生NAD+，一部分轉化為乙酰輔酶A，這兩種物質均與油脂合成密切相關，因此Pk表達量的提高可能會促進油脂合成。在40 mJ/cm2劑量下，accD和gapA的相對表達量呈較大幅度提高，Me和Pk的相對表達量基本不變，說明accD和gapA表達量的提高是促進油脂積累的主要驅動力。雖然80 mJ/cm2劑量下accD和gapA的表達量有所提升，但Me和Pk的表達量均下降，說明Me和Pk表達量的降低可能對油脂的積累產生一定的抑制。

2.5 不同紫外輻射劑量下小球藻油的脂肪酸組成和含量(見表5)

表5 不同紫外輻射劑量下小球藻油的脂肪酸組成和含量

由表5可見，共檢測出10種主要脂肪酸，包括5種飽和脂肪酸(SFA)、2種單不飽和脂肪酸(MUFA)、3種多不飽和脂肪酸(PUFA)。小球藻油主要的脂肪酸為棕櫚酸(C16∶0)、棕櫚油酸(C16∶1)、油酸(C18∶1)、亞油酸(C18∶2)和亞麻酸(C18∶3)。其中，C16∶1和C18∶1變化較大，與對照組相比，20～60 mJ/cm2劑量下的C16∶1和C18∶1含量明顯增加，40 mJ/cm2劑量下的提升幅度最大，MUFA含量達到40.17%，比對照組提高了16.5%。而MUFA更有利于生物柴油的生產，表明該劑量條件適合培育制備生物柴油的小球藻，在實際應用方面具有較高的價值。

3 結 論

綜合比較小球藻液紫外輻射后小球藻的生長、光合性能、油脂積累以及脂肪酸含量，確定40 mJ/cm2為最佳紫外輻射劑量。在40 mJ/cm2劑量下，小球藻的生長情況及光合性能較好，生物量與對照組(未進行紫外輻射)基本相等，葉綠素熒光參數降低幅度較小，且在很短的時間內即可恢復，最終的Fv/Fm，Y(Ⅱ)與對照組的熒光參數值接近。另外，輻射劑量為40 mJ/cm2的小球藻產油性能最佳，相對于對照組，油脂含量和油脂產量分別提高了39.40%和39.22%；與油脂合成相關的accD和gapA基因的相對表達量分別提高了約2.5倍和5倍，Me和Pk基因的相對表達量基本不變。而且，紫外輻射劑量對小球藻油脂肪酸組成及含量有一定影響，輻射劑量為40 mJ/cm2的小球藻油脂肪酸組成中的MUFA含量有較大幅度的提升，含量達到40.17%，比對照組提高了16.5%。