提高牛油基凝膠乳凍融穩(wěn)定性的研究

曹 晨，郭占陽，劉元法

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

冷凍儲(chǔ)藏是延長(zhǎng)食品貨架期的一個(gè)有效方法，冷凍后食品中的大部分水分結(jié)冰，抑制了微生物的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)低溫環(huán)境也降低氧化對(duì)食品的影響，使食品能夠長(zhǎng)期儲(chǔ)存[1]。但冷凍儲(chǔ)藏也會(huì)破壞食品中細(xì)胞組織和膠體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)期儲(chǔ)藏時(shí)，食品會(huì)因冷凍干耗而使品質(zhì)降低[2]。

在O/W型乳液基食品中，不相容的水、油兩相在兩親性乳化劑的作用下形成相容體系。在冷凍過程中，水和油脂結(jié)晶會(huì)破壞乳液的微觀結(jié)構(gòu)，使乳液在解凍后不能恢復(fù)到原來的狀態(tài)，出現(xiàn)破乳、絮凝、水乳分離的現(xiàn)象，穩(wěn)定性降低。乳液的凍融穩(wěn)定性主要受油相的組成、界面層的組成與厚度、水相中的溶質(zhì)、pH、膠體種類和濃度、冷凍速率、重結(jié)晶等因素的影響[3]。可通過增加界面層的厚度、改變電位、增加連續(xù)相的濃度、改變油相中的油脂組成、控制冰晶生長(zhǎng)、改變?nèi)橐褐苽錀l件、添加抗冷凍物質(zhì)等方式提高乳液的凍融穩(wěn)定性[4-7]。

凝膠乳屬于復(fù)合型脂肪替代物的一種，是通過蛋白質(zhì)變性、酶作用、添加凝膠或化學(xué)方法使乳液的連續(xù)相凝膠化或聚集乳液液滴形成的，凝膠乳具有固態(tài)特征，能夠很好地在形態(tài)上模擬動(dòng)物脂肪[8]。牛油基凝膠乳可用作制備人造雪花牛肉脂肪替代物，然而現(xiàn)階段凝膠乳凍融穩(wěn)定性差的問題限制了其作為脂肪替代物的應(yīng)用，而關(guān)于牛油基凝膠乳凍融穩(wěn)定性的研究還鮮有報(bào)道。

本研究基于實(shí)驗(yàn)室前期工作基礎(chǔ)[9]，選取明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.0%的明膠型牛油基凝膠乳，研究凝膠乳冷凍過程中的微觀結(jié)構(gòu)變化，分析凝膠乳凍融穩(wěn)定性差的原因，通過控制提升溶液的pH、提高溶液的Zeta電位結(jié)合控制冷凍過程中產(chǎn)生冰晶的大小提高凝膠乳的凍融穩(wěn)定性，為拓展牛油基凝膠乳在人造雪花牛肉中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

乳清分離蛋白(9410)，美國(guó)Hilmar公司；精煉牛油，中國(guó)張家港統(tǒng)清食品有限公司；牛骨明膠(凍力220)，河北潤(rùn)贏生物科技有限公司；無水葡萄糖、無水乙醇、三聚磷酸鈉，均為化學(xué)純。

T25高速剪切機(jī)，德國(guó)IKA公司；AH-2010高壓均質(zhì)機(jī)，加拿大ATS公司；TA·XT2i物性分析儀，英國(guó)SMS公司；DM2700P偏振光顯微鏡，德國(guó)Leica公司；MesoMR23-060V-I脈沖核磁共振儀(pNMR)，中國(guó)上海紐曼電子科技有限公司；Nano Brook Omni多角度粒度與高靈敏度Zeta電位分析儀，美國(guó)Bruker公司； Zetasizer nano ZS納米粒度與Zeta電位儀，英國(guó)馬爾文公司；D2 Phaser X-射線衍射儀，德國(guó)布魯克AXS有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牛油固體脂肪含量的測(cè)定

采用脈沖核磁共振儀測(cè)定牛油的固體脂肪含量。將牛油在80℃下熔化，裝入NMR專用玻璃管中，高度為4.0 cm，80℃水浴加熱30 min以上以消除油脂的結(jié)晶記憶。測(cè)試前用32℃金屬浴中儲(chǔ)藏的固體脂肪含量分別為0%、31.3%、74.6%的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品校正儀器，然后把消除結(jié)晶記憶后的樣品迅速放入0℃的水浴中，恒溫30 min后取出，用吸水紙迅速擦凈玻璃管表面的介質(zhì)并迅速測(cè)定其固體脂肪含量，然后依次將樣品放置在5、10、15、20、25、30、35、40、45、50℃下均衡30 min后測(cè)定固體脂肪含量，繪制牛油在不同溫度下的固體脂肪含量變化曲線。

1.2.2 凝膠乳的制備

以100 g凝膠乳制備為例。

(1)原料乳的制備。稱取3.0 g乳清分離蛋白(WPI)和27.0 g 150 mmol/L的NaCl溶液，室溫下攪拌2 h使乳清分離蛋白充分吸水膨脹，加熱至70℃恒溫30 min后，與70℃熔化的30.0 g牛油攪拌混合，降溫至55℃，10 000 r/min高速剪切2 min(每剪切30 s間隔30 s，剪切4次)，再在高壓均質(zhì)機(jī)中10 MPa下均質(zhì)2次(二級(jí)均質(zhì)閥為4 MPa)，制得原料乳。

(2)凝膠乳的制備。稱取3.0 g明膠顆粒,加入150 mmol/L NaCl溶液至40.0 g，室溫?cái)嚢? h使膠體充分吸水溶脹，加熱至70℃使明膠完全溶解，保持30 min后降溫到55℃，與原料乳混合，制得凝膠乳乳液，在4℃下凝固獲得固態(tài)凝膠乳(簡(jiǎn)稱凝膠乳)。

1.2.3 凝膠乳中牛油晶型測(cè)定

參照金燕[9]的乳液晶型測(cè)定方法。取適量的樣品于檢測(cè)片的圓孔內(nèi)，用載玻片將樣品壓平，移除多余的樣品，用X-射線衍射儀檢測(cè)凝膠乳中油脂的晶型。測(cè)定條件：Cu靶，電壓30 kV，掃描范圍(2θ)1.0°～40°。

1.2.4 凝膠乳乳液降溫過程微觀結(jié)構(gòu)的變化觀察

超聲清洗過的蓋玻片和載玻片放在55℃的加熱臺(tái)上，用移液槍吸取5 μL的凝膠乳乳液滴在載玻片的中央，從一側(cè)緩慢蓋上蓋玻片，避免中間產(chǎn)生氣泡，然后用注射器在蓋玻片的周圍小心涂上一薄層硅油，防止在溫度變化過程中水分蒸發(fā)。然后將制備好的樣品放在55℃恒溫的溫度控制臺(tái)上，找到合適的視野后固定，以5℃/min的速率降溫至-20℃，分別在55、20、4、-20℃時(shí)恒溫2 min，觀察微觀結(jié)構(gòu)，并用顯微鏡配備的數(shù)碼相機(jī)拍照記錄同一視野在普通光學(xué)顯微鏡和偏振光顯微鏡下的結(jié)構(gòu)，其中物鏡20×，目鏡10×。降溫過程中用低流速的氮?dú)鈿饬鞅Ｗo(hù)溫度控制臺(tái)，防止因溫度較低造成空氣中的水分在玻璃表面凝結(jié)影響觀察。

1.2.5 葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)冰晶顆粒的影響

用無水葡萄糖和去離子水分別制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、1.0%、3.0%、15.0%的葡萄糖溶液，在70℃下加熱30 min后降溫至55℃，然后按1.2.4方法觀察-20℃下的微觀結(jié)構(gòu)。

1.2.6 乳液Zeta電位和平均粒徑的測(cè)定

凝膠乳乳液用超純水按體積比1∶10的比例進(jìn)行梯度稀釋，最終稀釋1 000倍。取適量樣品室溫條件下用Zetasizer nano ZS 納米粒度與Zeta電位儀測(cè)定乳液的電位。室溫條件下用Nano Brook Omni多角度粒度與高靈敏度Zeta電位分析儀測(cè)定乳液的粒徑，分析相的折光指數(shù)1.33，顆粒的折光指數(shù)1.46。

1.2.7 凝膠乳質(zhì)構(gòu)測(cè)定

樣品處理：采用亞克力模板澆注成直徑為22 mm，高度為18 mm的圓柱體。將模板在4℃恒溫箱內(nèi)冷藏24 h以上，把制備好的凝膠乳乳液注入模板，蓋上蓋子后迅速放入4℃的恒溫箱中保持24 h，使得凝膠充分交聯(lián)[9]。樣品測(cè)試前在室溫下(20℃)穩(wěn)定2 h，然后使用物性分析儀測(cè)定硬度和彈性。測(cè)定條件：P35探頭，TPA模式，測(cè)試前速度1.00 mm/s，測(cè)試速度1.00 mm/s，測(cè)試后速度1.00 mm/s，測(cè)試形變30%，觸發(fā)力5.0 g。以第一次下壓的最大壓力值為硬度，兩次下壓的壓力值比為彈性。

1.2.8 凝膠乳持水力測(cè)定

準(zhǔn)確稱取5 g解凍后的凝膠乳于離心管中，4℃下10 000 r/min離心15 min，用濾紙小心把水分吸出，然后倒置15 min后用分析天平稱重，按下式計(jì)算持水力。

持水力=離心失水后凝膠乳的質(zhì)量/離心前凝膠乳的質(zhì)量×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 牛油的固體脂肪含量(見圖1)

圖1 牛油固體脂肪含量隨溫度變化曲線

由圖1可以看出：0℃時(shí)，牛油中固體脂肪含量為58.75%，牛油呈堅(jiān)硬的固態(tài)結(jié)構(gòu)；5～10℃時(shí)，固體脂肪含量有輕微升高，可能是牛油甘三酯組成復(fù)雜，5℃時(shí)牛油結(jié)晶不充分導(dǎo)致，之后隨著溫度升高，固體脂肪含量逐漸降低；45℃時(shí)，固體脂肪含量為1.08%，50℃時(shí)，固體脂肪含量為0，牛油轉(zhuǎn)變?yōu)橐簯B(tài)，表明實(shí)驗(yàn)采用的精煉牛油熔點(diǎn)在45～50℃之間，與李桂華等[10]的研究結(jié)果一致。同時(shí)，還可以看出，溫度低于凝固點(diǎn)后，固體脂肪含量會(huì)隨著溫度的降低而增加，形成油脂結(jié)晶。當(dāng)油脂中凝固點(diǎn)最高的甘油三酯達(dá)到過飽和狀態(tài)時(shí)，油脂會(huì)析出晶體，并且，隨著溫度的降低，晶體數(shù)目增多，顆粒變大[11]。脂肪凝固形成的大顆粒結(jié)晶會(huì)刺破脂滴的界面層，破壞乳液的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[12]。

2.2 凝膠乳中的油脂晶型

油脂的晶型主要有α、β′、β型，其中α晶型最不穩(wěn)定，易轉(zhuǎn)化為β′、β晶型，β′晶型的顆粒比較細(xì)小，β晶型的晶體比較粗大。油脂在結(jié)晶過程中所形成的晶型主要受油脂的降溫速率和儲(chǔ)藏過程中溫度波動(dòng)的影響[13]。圖2為凝膠乳的X衍射短間距圖譜。

圖2 凝膠乳的X衍射短間距圖譜

由圖2可見，凝膠乳中的油脂在短間距4.6、3.95、3.8 ?表現(xiàn)出強(qiáng)烈的衍射峰，表明在凝膠乳的降溫過程中主要形成了顆粒比較粗大的β型晶體，對(duì)凝膠乳界面層破壞較大。

2.3 凝膠乳乳液降溫過程微觀結(jié)構(gòu)的變化(見圖3)

由圖3可見，凝膠乳乳液降溫過程中微觀結(jié)構(gòu)有明顯變化，說明降溫過程中凝膠乳內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大的變化。55℃時(shí)，脂滴在普通光學(xué)顯微鏡下呈圓球狀，分散在連續(xù)相中，偏振光顯微鏡下為黑色，說明油脂中沒有晶體出現(xiàn)，此時(shí)凝膠乳為液狀。溫度降到25℃時(shí)，普通光學(xué)顯微鏡下可以看到脂滴的表面有輕微的裂紋，偏振光顯微鏡下有少量的白色油脂結(jié)晶，表明分散相中的牛油開始結(jié)晶。溫度降到4℃時(shí)，脂滴的表面有明顯的裂紋，偏振光顯微鏡下油脂晶體明顯增多、變大，說明降溫過程中油脂晶體不斷生長(zhǎng)，分散相油脂的結(jié)晶對(duì)凝膠乳的界面層造成了破壞[14]。溫度降到-20℃的過程中可以在顯微鏡中看到連續(xù)相的結(jié)冰過程，但結(jié)冰速率較快，在短時(shí)間內(nèi)完成，在-20℃時(shí)，脂滴的圓球表面裂紋更加明顯，表明凝膠乳的內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞更加嚴(yán)重，因?yàn)樾纬傻谋绊懥斯獾膫鞑ィ沟闷窆怙@微下的照片比較暗。冷凍過程中，冰晶和油脂晶體對(duì)凝膠乳的內(nèi)部結(jié)構(gòu)造成了不可逆的破壞，解凍時(shí)冰晶融化形成水，發(fā)生聚集的脂滴不能重新分散，界面層結(jié)構(gòu)被破壞使得水和油兩相直接接觸，水和油脂的不相容造成凝膠乳的疏水性增加，明膠的空間網(wǎng)絡(luò)不能完全恢復(fù)，這降低了對(duì)連續(xù)相中水的束縛能力，使凝膠乳的持水力降低。內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞也造成凝膠乳凍融后顏色變暗、結(jié)構(gòu)變硬、彈性變差，表現(xiàn)為凝膠乳的凍融穩(wěn)定性降低。其中冷凍與解凍的速率和方法、水相和油相的組成、界面層的組成和厚度、膠體種類和濃度都會(huì)對(duì)凝膠乳的凍融穩(wěn)定性造成影響。

注：A、C、E、G分別為55、25、4、-20℃時(shí)普通光學(xué)顯微鏡圖像；B、D、F、H分別為55、25、4、-20℃時(shí)偏振光顯微鏡圖像。

圖3 凝膠乳乳液降溫過程微觀結(jié)構(gòu)的變化

2.4 葡萄糖對(duì)冰晶顆粒的影響

冷凍食品品質(zhì)的穩(wěn)定性與冷凍過程中生成的冰晶大小及數(shù)量有關(guān)，冷凍過程中產(chǎn)生的冰晶越大，對(duì)食品的結(jié)構(gòu)破壞越大，減小凝膠乳冷凍過程中生成冰晶的大小可以減小冰晶對(duì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞，提高凝膠乳的凍融穩(wěn)定性[15]。水溶液中加入小分子物質(zhì)可以影響冰晶的顆粒大小，蘇蕾[16]的研究結(jié)果表明，水中加入葡萄糖(Glc)、飴糖、蔗糖、山梨醇、果葡糖漿等糖和糖醇能生成顆粒較小的冰晶，其中Glc的作用最為顯著。本文測(cè)試了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Glc溶液形成的冰晶情況，結(jié)果見圖4。

由圖4可以看出，Glc的質(zhì)量分?jǐn)?shù)直接影響溶液結(jié)冰時(shí)形成冰晶的大小。圖4A是不含Glc的去離子水凝固形成的冰，顯微鏡下冰是一個(gè)整體，幾乎沒有花紋。由圖4B可以看出，1.0%的Glc溶液形成的冰有明顯的花紋圖案，說明相同冷凍速率下形成了較小的冰晶。圖4C中深色的溝壑說明Glc質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到3.0%時(shí)，形成的冰晶在顯微鏡下有明顯的深花紋，表明溶液冷凍后形成了更細(xì)小的冰晶。圖4D的照片顏色較淺，花紋溝壑較深，是因?yàn)镚lc質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到15.0%時(shí)，形成了非常微小的冰晶。圖4結(jié)果說明在相同的冷凍速率下，增加Glc的質(zhì)量分?jǐn)?shù)能明顯降低水結(jié)冰時(shí)形成的冰晶大小。

注：A、B、C、D葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、1.0%、3.0%、15.0%。

圖4 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的葡萄糖溶液形成的冰晶

通過提高水相中Glc的含量控制凝膠乳冷凍時(shí)形成冰晶的大小，就可以減小冰晶對(duì)凝膠乳內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞，提高凝膠乳的凍融穩(wěn)定性。但是Glc具有一定的甜度，Glc質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加也會(huì)影響凝膠乳的口感，進(jìn)而影響凝膠乳作為脂肪替代物使用時(shí)制作的人造雪花牛肉的口感，應(yīng)當(dāng)控制Glc的用量，結(jié)合Ghosh等[17]關(guān)于Glc用量對(duì)乳液凍融穩(wěn)定性的研究結(jié)果，選定添加1.0%的Glc和0.8%的三聚磷酸鈉(Sodium tripolyphosphate, STPP)制備凝膠乳(制備方法同1.2.2,以添加1.0% Glc為例，WPI、精煉牛油和明膠用量不變，Glc用量為1.0 g，其余用150 mmol/L NaCl溶液補(bǔ)足至100 g),研究其對(duì)凝膠乳凍融穩(wěn)定性的影響。

2.5 凝膠乳的Zeta電位

Zeta電位是影響乳液穩(wěn)定性的一個(gè)重要性質(zhì)，電位的絕對(duì)值越高，脂滴之間的靜電排斥力越大，脂滴越難以聚集，形成的乳液體系越穩(wěn)定[18]。乳清分離蛋白是兩性乳化劑，等電點(diǎn)約為4.6，用乳清分離蛋白制備的O/W乳液在pH高于4.6時(shí)，乳液的Zeta電位為負(fù)值，增加乳液的pH可以增大電位的絕對(duì)值，并且提高pH有利于提高乳清分離蛋白的乳化性[19]。另外，在乳液的分散相中加入STPP可以提高乳液的pH，使乳液電位的絕對(duì)值增加。以1.2.2方法制備的凝膠乳為對(duì)照組，考察了分別添加1.0%Glc、0.8%STPP以及1.0%Glc+0.8%STPP所制備的凝膠乳的Zeta電位，結(jié)果見圖5。

注：a、b、c、d表示標(biāo)有不同字母的組間具有顯著性差異(P<0.05)，下同。

圖5 不同凝膠乳的Zeta電位

由圖5可知，對(duì)照組的Zeta電位為-14.28 mV，因?yàn)橹苽淠z乳的去離子水pH為中性，高于乳清分離蛋白的等電點(diǎn)，故其Zeta電位為負(fù)值。加入0.8%的STTP后Zeta電位為-21.50 mV。Glc對(duì)乳液的pH沒有影響，在凝膠乳中加入1.0%Glc的凝膠乳Zeta電位沒有明顯的變化，同時(shí)加入0.8% STPP和1.0%Glc的凝膠乳Zeta電位為-23.94 mV。

2.6 凝膠乳的平均粒徑

表1為不同凝膠乳乳液的平均粒徑。

由表1可見，加入0.8%STPP使凝膠乳乳液的平均粒徑明顯減小(P<0.05)，這是因?yàn)槿芤旱膒H增加使乳清分離蛋白的乳化性增強(qiáng)，相同均質(zhì)條件下制備的乳液平均粒徑更小，但Glc對(duì)乳液的粒徑?jīng)]有明顯的影響(P>0.05)。

表1 不同凝膠乳乳液的平均粒徑

注：a、b、c、d表示標(biāo)有不同字母的組間具有顯著性差異(P<0.05)。

2.7 凝膠乳的質(zhì)構(gòu)穩(wěn)定性

在冷凍過程中凝膠乳內(nèi)部結(jié)構(gòu)被破壞，解凍后，被破壞的膠體空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和聚集的脂滴不能恢復(fù)原來的狀態(tài)，使凝膠乳的硬度增大，彈性降低。提高凝膠乳的凍融穩(wěn)定性就是要減小對(duì)凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞，保持凝膠乳凍融前后的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。圖6和圖7分別為不同凝膠乳凍融前后的硬度和彈性。

圖6 不同凝膠乳凍融前后的硬度

圖7 不同凝膠乳凍融前后的彈性

由圖6可以看出，制備的凝膠乳均具有較低的硬度，4組凝膠乳的硬度沒有顯著區(qū)別(P>0.05)。冷凍造成凝膠乳的硬度增加，添加1.0%的Glc、0.8%的STPP均可使凝膠乳凍融前后的硬度差值明顯減小(P<0.05)，其中加入1.0%Glc+0.8%STPP的凝膠乳凍融后的硬度比對(duì)照組降低了124.08 g，說明加入Glc和STPP有利于減小凍融對(duì)硬度的影響。

由圖7可以看出，4組凝膠乳具有較好的彈性，彈性均在0.96以上，且4種凝膠乳的彈性沒有明顯區(qū)別(P>0.05)。冷凍過程造成的凝膠結(jié)構(gòu)的破壞使得凝膠乳的彈性降低，單獨(dú)加入1.0%Glc 或0.8%STPP相比對(duì)照組沒有明顯的變化(P>0.05)，而1.0%Glc+0.8%STPP凝膠乳凍融后的彈性為0.80，明顯高于對(duì)照組的0.68(P<0.05)，這說明通過減小冰晶的大小和增加乳液的pH可以減小冷凍對(duì)凝膠乳結(jié)構(gòu)的破壞，有利于保持凝膠乳凍融前后的質(zhì)構(gòu)穩(wěn)定。

2.8 凝膠乳的持水力

冷凍過程中生成的冰晶對(duì)凝膠乳的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)造成破壞，使得膠體網(wǎng)絡(luò)對(duì)水的束縛能力變差，界面層破壞使水和牛油直接接觸，減弱了凝膠乳的持水力。不同凝膠乳的持水力如圖8所示。

圖8 不同凝膠乳的持水力

由圖8可見，對(duì)照組的持水力為71.6%，加入1.0%的Glc減小冰晶對(duì)凝膠乳破壞可以增加其持水力(P<0.05)，加入0.8%的STPP持水力達(dá)到了83.6%(P<0.05)，是因?yàn)槿芤旱膒H偏離等電點(diǎn)時(shí)蛋白的結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，增加蛋白對(duì)水的束縛力。同單獨(dú)加入Glc或STPP相比，同時(shí)加入1.0% Glc和0.8%STPP的凝膠乳的持水力為98.0%，說明同時(shí)增加溶液的pH和減小冰晶顆粒的大小有協(xié)同提高凝膠乳持水力的作用(P<0.05)。

3 結(jié) 論

本研究首先對(duì)明膠型牛油基凝膠乳穩(wěn)定性差的原因進(jìn)行了分析，結(jié)果表明降溫過程中牛油凝固形成顆粒較大的β型晶體，和水相凝固形成的冰晶共同作用破壞了界面層和凝膠乳的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，是明膠型牛油基凝膠乳穩(wěn)定性變差的主要原因。添加1.0%Glc減小冰晶的大小，可減小冰晶對(duì)凝膠乳的破壞；添加0.8% STPP提升乳液的Zeta電位，減小乳液的粒徑，可增加凝膠乳的穩(wěn)定性。