HPLC檢測亞麻籽中開環(huán)異落葉松樹脂酚二葡萄糖苷的超聲波前處理工藝研究

于叢叢，黃健花，劉睿杰，常 明，王小三，王興國，金青哲

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

亞麻籽在我國內(nèi)蒙、河北、寧夏、山西等地區(qū)被廣泛種植，因其豐富的營養(yǎng)成分而備受歡迎。亞麻木酚素是亞麻籽特有的一類生理活性物質(zhì)，包括開環(huán)異落葉松樹脂酚二葡萄糖苷(簡稱SDG)、馬臺(tái)樹脂醇、羅漢松脂酚、落葉松樹脂醇等[1]。其中，SDG的含量最高[2]，占亞麻籽亞麻木酚素總量的95%以上[3]。SDG在抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、保護(hù)心血管、治療糖尿病等很多方面均有功效,特別在預(yù)防或抑制乳腺癌及治療骨質(zhì)疏松等方面功效顯著[4-5]。

目前國內(nèi)外亞麻木酚素的檢測方法大多采用HPLC法[6],在進(jìn)行HPLC檢測前，須進(jìn)行亞麻籽中SDG的溶劑萃取前處理，并且前處理效果直接影響SDG的檢測結(jié)果。已有文獻(xiàn)報(bào)道的溶劑萃取前處理方法包括索氏抽提法[7]、加熱回流法[8]、微波輔助法[9]等。索氏抽提法萃取效果欠佳、測得的SDG含量低，加熱回流法能耗大且不夠便捷，微波輔助法雖可顯著提高SDG的萃取效率,但容易引起萃取體系內(nèi)局部溫度過高，可能會(huì)引發(fā)溶劑大量揮發(fā)甚至爆炸等安全問題。超聲波輔助法作為一種常用的物理場輔助前處理法，其對萃取的輔助作用主要源于空化作用產(chǎn)生的極大壓力，可使得萃取目標(biāo)所在基質(zhì)瞬間被破碎，并引起微擾效應(yīng)、湍動(dòng)效應(yīng)、界面效應(yīng)等，具備傳質(zhì)效率高、省時(shí)高效、安全便捷等優(yōu)點(diǎn)，但目前鮮有文獻(xiàn)針對HPLC檢測亞麻籽中SDG的超聲波前處理工藝進(jìn)行研究。因此，本文以HPLC測定的亞麻籽中SDG含量為評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化超聲波輔助萃取亞麻籽SDG的工藝參數(shù)，確定最佳萃取工藝條件，為亞麻籽SDG含量的測定建立更有效適用的前處理方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

亞麻籽，產(chǎn)自新疆且由寧夏君星坊科技有限公司提供；SDG標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)，北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；甲醇、乙醇、乙腈、正己烷、冰乙酸、氫氧化鈉、濃鹽酸等，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇，色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超純水，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Waters 1525高效液相色譜儀，Waters 2996可變波長二極管陣列檢測器；KH7200DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；R-501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHB-3循環(huán)水真空泵，上海申順生物科技有限公司；AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；Anke TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 亞麻籽的預(yù)處理

稱取經(jīng)除雜的亞麻籽450.0 g(精確至0.1 g)，將其粉碎，按料液比1∶5加入正己烷，50℃攪拌(200 r/min)6 h，抽濾、揮干溶劑、粉碎、過20目篩即得脫脂亞麻籽粉[10]，冷藏備用。

1.2.2 SDG檢測的超聲波輔助萃取前處理

稱取1.500 g(精確至0.001 g)脫脂亞麻籽粉，依次加入一定料液比的溶劑，置于一定溫度的恒溫水浴中，在一定超聲功率下萃取一定時(shí)間，離心并合并萃取一定次數(shù)的上清液，旋蒸后加入4.5 mL 0.3 mol/L的NaOH溶液，常溫水解6 h，再加入0.6 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至6.5～7.5，旋蒸去除溶劑，加入色譜純甲醇溶解并定容至10 mL，用0.45 μm醋酸纖維素膜過濾，采用HPLC測定SDG含量(以每克脫脂亞麻籽粉所含的SDG含量計(jì))。

1.2.3 HPLC測定SDG含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

稱取SDG標(biāo)準(zhǔn)品5.00 mg(精確到0.01 mg)，色譜純甲醇溶解定容配制成0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，定容稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為0.5、0.2、0.08、0.032、0.128、0.005 12 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。參考Li等[11]的方法(略作改動(dòng))，進(jìn)行HPLC檢測并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

色譜條件：流動(dòng)相A相為超純水-乙酸(體積比98∶2)，B相為甲醇；柱溫30℃；流速0.8 mL/min；洗脫梯度為0 min時(shí)85%A、15%B，20 min時(shí)85%A、15%B，30 min時(shí)72%A、28%B，40 min時(shí)72%A、28%B，60 min時(shí)45%A、55%B，70 min時(shí)45%A、55%B，80 min時(shí)15%A，85%B，81 min時(shí)85%A、15%B，91 min時(shí)85%A、15%B。

經(jīng)擬合得到SDG標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=1×107x-99 803，其中x為峰面積、y為SDG質(zhì)量濃度，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 4。

1.2.4 HPLC測定亞麻籽樣品中SDG含量

取1.2.2所制取樣品按1.2.3進(jìn)行HPLC測定，將峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，計(jì)算SDG含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取溶劑的選擇

在料液比1∶20、超聲溫度35℃、超聲功率800 W的條件下超聲2 h，萃取次數(shù)1次，考察萃取溶劑對SDG含量的影響。根據(jù)SDG的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，選用極性溶劑進(jìn)行萃取前處理，所選溶劑為乙醇、甲醇、乙腈及90%的甲醇-水溶液，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可以看出，90%甲醇-水溶液作為萃取溶劑時(shí)SDG含量很低，這是因?yàn)樵谛羧コ軇┑倪^程中，整個(gè)溶液體系出現(xiàn)起泡現(xiàn)象，導(dǎo)致樣品損失，從而使得SDG含量很低，因此含水有機(jī)溶劑不適合用作萃取劑。而在純?nèi)軇┑膶Ρ戎校?種溶劑萃取所得SDG含量由低到高依次為乙醇<乙腈<甲醇，并且差異較大，甲醇萃取效果最好，因此確定萃取溶劑為甲醇。

2.2 料液比的選擇

以甲醇為萃取溶劑，在超聲溫度35℃、超聲功率800 W的條件下超聲2 h，萃取次數(shù)1次，考察料液比對SDG含量的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 料液比對SDG含量的影響(n=3)

由圖2可以看出，SDG含量隨料液比的增大而增加。當(dāng)料液比超過1∶20后，SDG含量增加幅度非常小。說明增加溶劑用量，濃度差提高，傳質(zhì)效率高，而料液比超過一定值后，溶液間傳質(zhì)速率基本為0，SDG含量基本不再增加[11]，因此將料液比確定為1∶20。

2.3 超聲時(shí)間的選擇

以甲醇為萃取溶劑，在料液比1∶20、超聲溫度35℃、超聲功率800 W的條件下超聲前處理，萃取次數(shù)1次，考察超聲時(shí)間對SDG含量的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 超聲時(shí)間對SDG含量的影響(n=3)

由圖3可以看出，隨著超聲時(shí)間的延長，SDG含量隨之增加，當(dāng)超聲時(shí)間超過2 h后，SDG含量趨于平穩(wěn)、甚至開始略微下降，但含量無顯著性差異。結(jié)果表明，超聲時(shí)間過短，導(dǎo)致SDG萃取不充分，超聲時(shí)間過長，SDG溶解達(dá)到平衡，溶劑略微揮發(fā)，反而使得SDG含量有所下降。同時(shí)考慮到選擇恰當(dāng)?shù)某晻r(shí)間利于節(jié)約能源等，故將超聲時(shí)間確定為2 h。

2.4 超聲溫度的選擇

以甲醇為萃取溶劑，在料液比1∶20、超聲功率800 W的條件下超聲2 h，萃取次數(shù)1次，考察超聲溫度對SDG含量的影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可以看出，隨著超聲溫度的升高，SDG含量逐漸增加，超聲溫度超過35℃后，SDG含量開始呈現(xiàn)下降趨勢。表明隨著溫度的升高，分子擴(kuò)散溶解快，SDG分子可以溶解到溶劑中，但溫度過高，SDG較容易受到破壞[12-13]，而導(dǎo)致SDG含量下降，因此將超聲溫度確定為35℃。

圖4 超聲溫度對SDG含量的影響(n=3)

2.5 超聲功率的選擇

以甲醇為萃取溶劑，在料液比1∶20、超聲溫度35℃的條件下超聲2 h，萃取次數(shù)1次，考察超聲功率對SDG含量的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 超聲功率對SDG含量的影響(n=3)

由圖5可以看出，隨著超聲功率的增大，SDG含量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，在超聲功率超過800 W后，SDG含量開始下降。這可能是因?yàn)槌暡〞?huì)對SDG產(chǎn)生一定的破壞作用[7]。綜合考慮，將超聲功率確定為800 W。

2.6 萃取次數(shù)的選擇

以甲醇為萃取溶劑，在料液比1∶20、超聲溫度35℃、超聲功率800 W的條件下超聲2 h，考察萃取次數(shù)對SDG含量的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 萃取次數(shù)對SDG含量的影響(n=3)

由圖6可以看出，隨著萃取次數(shù)的增加，SDG含量明顯增加，但萃取次數(shù)超過3次后，SDG含量基本不發(fā)生變化。同時(shí)考慮充分萃取及試驗(yàn)操作等因素[14]，將萃取次數(shù)確定為3次，此時(shí)SDG含量為11.40 mg/g。

3 結(jié) 論

本文對HPLC測定亞麻籽中SDG含量的超聲波輔助萃取前處理?xiàng)l件進(jìn)行了研究，通過單因素試驗(yàn)確定了超聲波輔助萃取前處理的最佳條件：以甲醇為萃取溶劑，料液比1∶20，超聲時(shí)間2 h，超聲溫度35℃，超聲功率800 W，萃取次數(shù)3次。在最佳條件下，測得亞麻籽中SDG含量為11.40 mg/g。