蛹擬青霉固態發酵法制備大豆渣小肽及其理化特性

朱蘊蘭，陳宏偉，陳安徽，韓 硯，戶澤榮，孫 雅，胡路路

(徐州工程學院 食品(生物)工程學院，江蘇省食品生物加工工程技術研究中心，江蘇省食品資源開發與質量安全重點建設實驗室，江蘇 徐州 221111)

大豆渣是大豆加工過程中產生的主要副產物，我國每年產生的大豆渣在2 000萬t左右[1]，多數被用于飼料或肥料。大豆渣中含有大量的蛋白質、脂肪和膳食纖維等成分[2]，可以進一步提取加工成多糖、異黃酮、多酚、植酸、尿酶、膳食纖維、小肽、大豆渣食品等產品，使之得到高值化利用[3-5]。

大豆肽是大豆蛋白經酶解、酸解或發酵后產生的一種低相對分子質量的多肽混合物，其中含有少量游離氨基酸、糖類等成分。大豆肽具有降血壓、降血脂、降血糖、促進能量代謝、減少脂肪生成以及免疫調節等多種生理功能[6-10]，而且抗原性弱，不會引起過敏反應。大豆肽的制備方法主要是酶法和發酵法。酶法是食品工業生產大豆肽的最常見技術[11]，但因生產成本和相關操作技術的制約，不能滿足發展的需求。而微生物發酵法制備大豆肽是一種較先進且極其有效的方法，可以降低酶法制備大豆肽的成本，減少工藝環節，使大豆肽能夠在微生物代謝活動產生的混合酶作用下釋放出來，效率更高。微生物發酵法生產的大豆肽不是簡單地將大豆蛋白質切成小肽，而是將釋放的小肽通過移接和重排，經過微生物作用對某些苦味基團進行修飾、轉移和重組，使制得的大豆肽具有更好的溶解性，無苦味，提高其應用價值[11]。微生物在發酵過程中產生的一些次級代謝產物還可以有效改善大豆肽的風味[12-13]。大豆蛋白經微生物發酵后，形成大豆肽和小分子的混合物，具有溶解度好、黏度低、易吸收等特點和降血脂、抗疲勞的生理功能[14]。

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris(L.ex.Fr) Link)別名北冬蟲夏草、蛹草、北蟲草等，是一種藥食兩用真菌，具有與冬蟲夏草相似的調節免疫、抗衰老、抗腫瘤等功效。蛹蟲草無性型蛹擬青霉(Paecilomycesmilitaris)具有較強的轉化蛋白質能力，可以使發酵基質發生化學轉化產生具有新的功能的化學成分。利用微生物發酵法制備大豆肽的研究已有很多[15-17]，但利用蛹蟲草無性型蛹擬青霉發酵大豆副產物大豆渣制備大豆肽的研究還未見報道。本研究以蛹擬青霉為發酵菌種對大豆渣進行發酵，優化制備大豆渣小肽的工藝參數，并對制備的大豆渣小肽的加工特性和抗氧化能力進行研究，為進一步提高大豆渣的利用，豐富市場產品種類提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

蛹擬青霉，江蘇省食品資源開發與質量安全重點建設實驗室提供；東北大豆，購于徐州市綠地華聯超市；大豆蛋白，蛋白質含量大于40%，購于河南省鯤華生物技術有限公司。

三氯乙酸、95%乙醇、十二烷基硫酸鈉(SDS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)、過硫酸銨(APS)、K2S2O8、NaCl、考馬斯亮藍R250、乙酸、2,2’-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，分析純；蛋白胨、酵母浸膏，化學試劑。

SDAY固體培養基：酵母浸出粉10 g，葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，pH 6.0，水1 000 mL。

SDY液體培養基：酵母浸出粉10 g，葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，pH 6.0，水1 000 mL。

1.1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD型超凈工作臺,上海博迅實業有限公司；HYG型恒溫培養搖床，上海一恒科學儀器有限公司；HH-B11.500s型電熱恒溫培養箱，上海躍進醫療機械有限公司；ALC.2100.1型電子天平，上海精密科學儀器有限公司；TGL-16G臺式離心機，上海精密儀器儀表有限公司；LD2X-SOKBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械有限公司；TU-1810型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；Alphrl-2LD plus冷凍干燥機，德國Christ公司；1000Y高速粉碎機，上海利聞科學儀器有限公司；XT-9900智能微波消解儀，上海新拓分析儀器科技有限公司；Snb-1旋轉黏度計，上海平軒科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化與種子制備

將蛹擬青霉菌種接種到SDAY斜面培養基上，在22℃培養7～10 d至斜面長滿菌絲。把活化的蛹擬青霉斜面菌種轉接到盛有200 mL SDY液體培養基的三角瓶中，每瓶接種1 cm2的菌塊2～3塊，22℃、120 r/min培養3～5 d得到蛹擬青霉種子液。

1.2.2 大豆渣及發酵培養基的制備

將挑選后的大豆在20～22℃水中浸泡8 h，過濾掉多余水，然后加入8倍的水(以原料大豆質量為基準)，用豆漿機打漿后，用40目篩子過濾，將濾渣在3 000 r/min下離心3 min，收集沉淀物得到大豆渣。將50 g大豆渣盛于250 mL三角瓶內，121℃滅菌30 min，得到大豆渣發酵培養基。

1.2.3 蛹擬青霉固態發酵制備大豆渣小肽

在大豆渣發酵培養基中按一定接種量接種蛹擬青霉種子液，在一定溫度下發酵不同時間后，經冷凍干燥、粉碎、過40目篩得到大豆渣小肽。

1.2.4 小肽含量測定

稱取大豆渣小肽10 g，加60 mL 15%三氯乙酸溶液，充分混合后定容至100 mL，3 000 r/min下離心20 min，取上清液10 mL，經微波消解后，用凱氏定氮法測定酸溶蛋白含氮量[18]；取0.5 g大豆進行上述操作，用凱氏定氮法測定大豆含氮量[18]。按下式計算小肽含量。

小肽含量=酸溶蛋白含氮量/大豆含氮量×100%

1.2.5 SDS-PAGE電泳測定大豆渣小肽相對分子質量

大豆渣小肽經蒸餾水溶解、浸提、離心后取上清液待測。SDS-PAGE測定條件：上層膠濃度5%，下層膠濃度10%，電泳電壓200 V。SDS-PAGE結束后，用凝膠成像儀對凝膠進行拍照分析。

1.2.6 大豆渣小肽溶解度的測定

稱取大豆渣小肽1 g，加入19 mL水，充分攪拌均勻。然后按文獻[19-20] 的方法，取上清液測定氮含量，按下式計算氮溶解指數。

氮溶解指數=大豆渣小肽中可溶性氮含量/樣品中總氮含量×100%

1.2.7 大豆渣小肽表觀黏度測定

稱取一定量的大豆渣小肽，加水，混勻，并使用磁力攪拌器以200 r/min的速度攪拌20 min，使其充分溶解，制成質量濃度為50～300 mg/mL的小肽液[22]。然后采用旋轉黏度計測定pH 7.0、25℃下的大豆渣小肽液與大豆蛋白液的表觀黏度[21]。

1.2.8 大豆渣小肽乳化性及乳化穩定性測定

參考文獻[22-25] 的方法制備不同質量濃度的小肽液，然后分別取100 mL置于250 mL的燒杯中，一邊攪拌一邊緩慢加入30 mL食用油，均質5 min后，制成乳狀液。吸取乳狀液50 μL，與25 mL 0.1%的SDS溶液混合，充分搖勻后，使用分光光度計在550 nm處測定吸光值(A)，并以乳化性指數(EAI=A×100)表示乳化性，15 min后再次測定吸光值(A′)，按下式計算乳化穩定性。

乳化穩定性=A′/A×t

式中：t為時間間隔。

1.2.9 ABTS+自由基和 DPPH自由基清除率的測定

將大豆渣小肽按料液比1∶50加入雙蒸水，25℃、200 r/min下振蕩提取24 h后，6 000 r/min離心10 min，取上清液測定ABTS+自由基和DPPH自由基清除率，測定方法按文獻[26] 進行。以未發酵大豆渣作對照。

1.2.10 數據分析

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 發酵溫度對小肽含量的影響

在菌種接種量10%、發酵時間13 d的條件下，發酵溫度對小肽含量的影響如圖1所示。

注：字母不同表示差異極顯著(P<0.01)，下同。

圖1 不同發酵溫度下的小肽含量

從圖1可以看出，在20～22℃小肽含量隨發酵溫度升高而升高，在22～24℃隨發酵溫度升高小肽含量降低，在22℃時小肽含量最高，達到11.65%。已有研究表明，蛹擬青霉的最適生長溫度為22℃，在本固態發酵過程中溫度對小肽含量的影響主要體現在對代謝酶活力的影響，適宜的溫度可以使酶活力增強，代謝速度加快，從而使大豆渣蛋白質的分解速度加快，最終使大豆渣小肽含量增加。

2.1.2 接種量對小肽含量的影響

在發酵溫度22℃、發酵時間13 d的條件下，接種量對小肽含量的影響如圖2所示。

圖2 不同接種量下的小肽含量

從圖2可以看出，接種量在5%～10%時，小肽含量逐步上升，在接種量10%時小肽含量達到最高，為11.35%。接種量決定發酵的初始速度，適當的接種量可以在不影響發酵培養基原有成分的同時提高發酵物的最初微生物數量，從而加快發酵基質的分解代謝速度。

2.1.3 發酵時間對小肽含量的影響

在菌種接種量10%、發酵溫度22℃的條件下，發酵時間對小肽含量的影響如圖3所示。

圖3 不同發酵時間下的小肽含量

從圖3可以看出，發酵時間在11～13 d范圍內，小肽含量逐漸增高，發酵13 d時小肽含量達到最高，為11.60%。方差分析顯示，發酵11 d和13 d的小肽含量之間存在極顯著差異，但發酵13 d和15 d的小肽含量之間無顯著差異(P>0.05)。發酵時間過短不能將發酵基質完全利用，發酵時間過長會導致發酵底物被完全利用并產生代謝副產物或有害物質阻礙發酵過程的進行。

2.2 正交實驗

在單因素實驗的基礎上，通過正交實驗優化發酵條件。正交實驗因素水平見表1，正交實驗設計與結果見表2，方差分析見表3。

表1 正交實驗因素水平

表2 正交實驗設計與結果

從表2可以看出，各因素對小肽含量影響的主次順序為發酵時間>發酵溫度>接種量。從表3可以看出，發酵溫度和發酵時間對小肽含量有顯著影響(P<0.05)，而接種量對小肽含量無顯著影響(P>0.05)。從表2極差分析可以看出，最優方案為A2B3C2，即接種量10%、發酵溫度 22℃、發酵時間15 d。在最優條件下進行驗證實驗，測得發酵大豆渣的小肽含量為15.35%。

表3 方差分析

2.3 大豆渣小肽的理化性質

2.3.1 大豆渣小肽的相對分子質量

經SDS-PAGE測定大豆渣小肽的相對分子質量，結果如圖4所示。

注：M. Marker；1.大豆蛋白；2.發酵5 d的大豆渣小肽；3、4.發酵9 d的大豆渣小肽；5、6.發酵11 d的大豆渣小肽；7.發酵13 d的大豆渣小肽；8.發酵15 d的大豆渣小肽。

圖4 大豆蛋白及大豆渣小肽SDS-PAGE圖譜

從圖4可以看出，隨著發酵時間的延長，發酵大豆渣小肽的相對分子質量越來越小，發酵9 d開始出現小肽，發酵11 d的大豆渣小肽相對分子質量多數在15 kDa以下。另外，從圖4可見，條帶7和條帶8，15 kDa以下的小肽較少，可能是因為發酵時間長，小肽相對分子質量很小，跑帶比較快，未能在條帶上顯示。

2.3.2 大豆渣小肽的溶解度(見圖5)

圖5 不同pH下大豆渣小肽和大豆蛋白的溶解度

由圖5可知，大豆蛋白的溶解度受pH影響比較大，特別是在等電點pH 4～6時幾乎不溶解，而大豆渣小肽的溶解度受pH的影響很小，其在pH 1～10下都具有很好的溶解度，NSI達到95%以上。

2.3.3 大豆渣小肽的表觀黏度(見圖6)

由圖6可知，當質量濃度在50～100 mg/mL之間時，大豆蛋白的表觀黏度變化十分平緩且波動很小，當質量濃度高于100 mg/mL時，其表觀黏度呈直線上升狀態。大豆渣小肽溶液的質量濃度在50～300 mg/mL范圍內時，其表觀黏度基本不受溶液質量濃度的影響，變化幅度很小，保持在9.8 mPa·s。

圖6 不同質量濃度的大豆渣小肽液和大豆蛋白液的表觀黏度

2.3.4 大豆渣小肽的乳化性及乳化穩定性(見表4)

表4 不同質量濃度的大豆蛋白液和大豆渣小肽液的乳化性和乳化穩定性

由表4可知，大豆渣小肽的乳化性和乳化穩定性均隨著溶液質量濃度的增高而增加(P<0.01)，但大豆渣小肽的乳化性和乳化穩定性小于大豆蛋白(P<0.01)。

2.3.5 大豆渣小肽的抗氧化活性

利用DPPH和ABTS法測定的大豆渣小肽的抗氧化活性。結果表明，經發酵大豆渣制備的小肽具有較好的抗氧化活性，清除DPPH自由基和ABTS+自由基能力均比未發酵大豆渣高，方差分析顯示發酵大豆渣小肽與未發酵大豆渣抗氧化活性具有顯著差異(P<0.01)。經發酵大豆渣制備的小肽對DPPH 自由基和ABTS+自由基清除率分別達到58.33%和63.38%，比未發酵大豆渣分別提高了2.72倍和1.74倍。

張杉杉等[26]測定了蛹蟲草固態發酵豆渣的抗氧化活性，表明發酵豆渣的DPPH自由基清除力是未發酵豆渣的2.94倍，發酵豆渣對ABTS+自由基清除能力比未發酵豆渣提高了15.6%，本實驗研究結果與之相似。

3 結 論

以小肽含量為指標，利用蛹擬青霉對大豆渣進行固態發酵，通過單因素實驗和正交實驗，確定蛹擬青霉固態發酵大豆渣的優化條件為：接種量10%，發酵溫度22℃，發酵時間15 d。在最優條件下，小肽含量達到15.35%，小肽相對分子質量多數在15 kDa以下。大豆渣小肽具有較好的溶解性，pH對其影響很小，氮溶解指數達到95%以上。大豆渣小肽表觀黏度不受溶液質量濃度的影響，且變化幅度很小，保持在9.8 mPa·s，具有良好的流動性。大豆渣小肽具有一定的乳化性和乳化穩定性，且隨著溶液質量濃度的增加而增強，但與大豆蛋白相比略小，但發酵豆渣制備的小肽由于相對分子質量小，使其物理特性更為明顯。發酵大豆渣小肽比未發酵豆渣具有更好的抗氧化能力，本研究為進一步利用大豆渣開發大豆肽功能性食品、推進食品行業的發展提供了理論依據。