沙棘果油納米乳液的性質與抗氧化活性研究

蔣忠榮，張 濤，王 濤，常 明，劉睿杰，金青哲，王興國

(江南大學 食品學院，江蘇省食品安全與質量控制協同創新中心，國家功能食品工程技術研究中心，江蘇 無錫 214122)

沙棘作為一種藥食同源的植物，從1977年就被衛生部列入《中國藥典》，而沙棘果油作為沙棘果實的精華，是沙棘中最有價值的成分之一。沙棘果油主要有兩種來源，由沙棘鮮果或果漿通過水酶法或離心分離的方法獲得沙棘果油[1]，或由沙棘干果通過超臨界、亞臨界或溶劑提取等方式制得沙棘果油，也稱沙棘全果油[2]。沙棘果油作為一種功能性油脂，具有獨特的脂肪酸組成，不僅富含油酸和亞油酸，其棕櫚油酸含量明顯高于一般植物油。此外，沙棘果油中還含有豐富的生育酚、植物甾醇、類胡蘿卜素、黃酮等脂質伴隨物，具有優異的抗氧化效果，具有開發為營養功能豐富的脂肪乳飲料的潛在價值。但沙棘果油及其中的多種有益伴隨物均為脂溶性物質，限制了其在飲料等水相中的應用。

近年來，食品級納米乳液作為一種簡單有效的包埋運輸體系，已被廣泛應用于功能性油脂和各種油溶性營養素的包埋與傳遞，能夠防止功能營養成分被氧化，并提高其水溶性和生物利用率[3]。納米乳液與普通乳液最大的區別還在于其在儲存過程中可以抵抗絮凝、聚結以及重力分離，是一種“近熱力學穩定”體系[4]。另外，利用乳液包埋技術可以在一定程度上降低沙棘果油的固有風味，使其更容易被消費者所接受。納米乳液的制備方法包括高能法和低能法[3]，高壓均質乳化技術作為常用的高能法制備納米乳液技術，具有乳液粒徑小、分布均勻、乳液體系穩定、表面活性劑的需求量小等優勢[5]。目前，利用高壓均質乳化技術制備納米乳液，已有關于紅麻籽油納米乳液[6]、姜油納米乳液[7]、魚油納米乳液[8]、肉桂精油納米乳液[9]、β-胡蘿卜素納米乳液[10]等的研究，但是還未見對沙棘果油納米乳液的研究。

本文以酪蛋白酸鈉作為乳化劑，采用高壓均質的方法制備沙棘果油納米乳液。分析5種沙棘果油樣品的脂肪酸和主要脂質伴隨物組成，并對制得的沙棘果油納米乳液特性及穩定性、細胞毒性、細胞抗氧化活性進行研究，以期為沙棘果油脂肪乳產品及相關保健品開發應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

5種沙棘果油樣品來源于5家合作企業的工廠(1、2、3號產地分別為黑龍江、甘肅、新疆，4、5號產地為青海)，生產過程未添加抗氧化劑，-20℃冰箱避光保存。酪蛋白酸鈉，購于上海麥克林生化科技有限公司；2′,7′-二氯熒光二乙酸鹽(DCFH-DA)、2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(ABAP)，均購于美國Sigma-Aldrich公司；正己烷、異丙醇、甲醇和二氯甲烷為色譜純，其他試劑為分析純。

1.1.2 儀器與設備

Ultra-Turrax T25高速分散機、HPH2000/4-SH5超高壓均質機，德國Ika儀器設備有限公司；Nano Brook Omni多角度粒度與高靈敏度Zeta電位分析儀，美國Brookhaven儀器公司；MS-S標準型磁力攪拌器；Fluoroskan Ascent FL熒光酶標儀、Trace GC MLtra氣相色譜儀、ISQ質譜檢測儀，美國Thermo公司；7820氣相色譜儀，美國Agilent公司；Waters1525高效液相色譜儀，美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 沙棘果油脂肪酸組成分析

稱取0.05 g油樣溶于2 mL正己烷，加入500 μL 2 mol/L的氫氧化鉀-甲醇溶液，旋渦振蕩混勻，離心，取上層有機相，加入適量無水硫酸鈉，過膜后進行氣相色譜檢測。氣相色譜條件參考文獻[11]。

1.2.2 生育酚含量測定

稱取1.0 g油樣，在10 mL棕色容量瓶中用正己烷溶解定容后過膜,按參考文獻[12]測定生育酚含量。

1.2.3 植物甾醇含量測定

采用氣相色譜質譜聯用法(GC-MS)測定沙棘果油中植物甾醇含量[13]。

1.2.4β-胡蘿卜素含量測定

采用反相高效液相色譜法測定β-胡蘿卜素含量，樣品前處理方式參照劉慧敏[11]的方法。反相高效液相色譜條件：檢測波長450 nm，流動相為甲醇-二氯甲烷(體積比7∶3)，流速1.0 mL/min，進樣量20 μL。

1.2.5 沙棘果油納米乳液的制備

沙棘果油納米乳液的制備方法在易江[14]方法的基礎上稍加修改。以酪蛋白酸鈉為乳化劑，配制質量分數為2%的水溶液，磁力攪拌器室溫下攪拌過夜，使其充分水化。將蛋白質水溶液和5種不同來源的沙棘果油按照質量比9∶1混合，用高速分散機在20 000 r/min下剪切4 min，剪切30 s停30 s，制成粗乳液。然后用超高壓均質機在均質壓力100 MPa、循環次數4次的條件下制備沙棘果油納米乳液，采用冰水浴降溫。在制備過程中，所有容器均使用錫箔紙包裹，以保證沙棘果油中脂質伴隨物在制備過程中盡可能少的損失。

1.2.6 沙棘果油納米乳液特性表征

用Nano Brook Omni多角度粒度與高靈敏度Zeta電位分析儀測定沙棘果油納米乳液的平均粒徑、多分散系數(PDI)以及Zeta電位，測量角度選取90°，粒徑范圍選取50～250 nm，沙棘果油油滴的折射率設置為1.45，水相折射率為1.33。為降低多重光散射效應，測定前用超純水將沙棘果油納米乳液稀釋100倍。

1.2.7 沙棘果油納米乳液離心穩定性的測定

在Xu等[5]方法的基礎上稍加修改測定沙棘果油納米乳液離心穩定性。取100 μL沙棘果油納米乳液樣品用超純水稀釋100倍，在2 000g下離心20 min，小心吸取等量離心前后相同位置下層樣品旋渦振蕩后，在500 nm下測定吸光度。按照下式計算表征離心穩定性的Ke值。

1.2.8 沙棘果油納米乳液細胞毒性的測定

參照Wolfe[15]、王立峰[16]等的方法研究沙棘果油納米乳液的細胞毒性作用。接種量調整為2×104個/孔，去離子水清洗次數6次及以上，至無浮色。以不加沙棘果油納米乳液樣品的培養基作為對照，沙棘果油納米乳液的半數抑制濃度(IC50)通過質量濃度-細胞存活率曲線擬合計算得到。

1.2.9 沙棘果油納米乳液的細胞抗氧化活性評價

參照Wolfe等[15]建立的細胞抗氧化活性評價模型和張志艷[17]的細胞抗氧化活性測定方法。接種量調整為3×104個/孔，對照組無沙棘果油納米乳液樣品處理，空白組無沙棘果油納米乳液樣品處理并在棄去磷酸鹽緩沖液(PBS)后添加不含ABAP的Hank平衡鹽溶液(HBSS)。對每個樣品繪制時間-熒光值曲線并進行積分，表征細胞抗氧化活性的CAA值通過下式進行計算。

1.2.10 數據分析

每次實驗均至少重復兩次，求平均值，利用Origin 2018數據處理軟件作圖并計算平均值和標準差。

2 結果與討論

2.1 沙棘果油的主要組成

2.1.1 脂肪酸組成

5種沙棘果油樣品脂肪酸組成及相對含量如表1所示。

表1 沙棘果油的脂肪酸組成及相對含量 %

由表1可知，5種沙棘果油樣品的主要脂肪酸包括不飽和脂肪酸如棕櫚油酸(32.23%～35.24%)、油酸(20.33%～22.86%)、亞油酸(7.16%～8.19%)和亞麻酸(2.52%～3.05%)，以及飽和脂肪酸如棕櫚酸(28.92%～32.52%)和硬脂酸(1.53%～2.77%)，總體脂肪酸含量差異不大。單不飽和脂肪酸占54.97%～56.56%，其中棕櫚油酸含量高達32.23%～35.24%，這是沙棘果油脂肪酸組成區別于一般植物油的特點。棕櫚油酸是一種n-7單不飽和脂肪酸，主要存在于魚油或海洋浮游生物中，在一般油料作物中含量較少，目前由于其具有改善胰島素抵抗、調節糖脂代謝的生理功能備受關注。

2.1.2 脂質伴隨物

沙棘果油含有豐富的有益脂質伴隨物，5種沙棘果油樣品生育酚、植物甾醇、β-胡蘿卜素組成及含量如表2所示。

表2 沙棘果油脂質伴隨物組成和含量 mg/kg

由表2可知，5種沙棘果油樣品的生育酚總量在188.28～244.18 mg/kg的范圍內波動，其中85%以上為α-生育酚，而β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚含量很少。植物甾醇中β-谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇總量在6 994.34～11 091.26 mg/kg之間，4號沙棘果油3種甾醇總量(11 091.26 mg/kg)和β-谷甾醇含量(10 736.08 mg/kg)明顯優于另外4種樣品。5種沙棘果油樣品中β-胡蘿卜素含量(183.25～241.25 mg/kg)均較高，這是沙棘果油呈現黃色或橙紅色的主要原因。

2.2 沙棘果油納米乳液的特性表征(見表3)

從表3可以看出，經過高壓均質后，5種沙棘果油納米乳液平均粒徑范圍在156.3～173.4 nm之間，相比經過剪切預乳化的粗乳液粒徑(大于1 200 nm)有明顯的減小，均達到納米級別(小于200 nm)。5種沙棘果油納米乳液的PDI小于0.3，說明沙棘果油納米乳液均勻程度良好[18]。在相同的乳化劑比例和均質條件下，不同來源的沙棘果油制得的乳液平均粒徑和PDI等乳液性質存在一定的差異，可能是由于油相中脂肪酸以及脂質伴隨物組成不同，導致乳化劑與油相的分布出現差異，進而使乳液特性產生差異。Zeta電位分析的數據表明沙棘果油乳滴顆粒帶負電且絕對值較大，這是由于酪蛋白酸鈉在該水相體系中帶負電，形成水包油型納米乳液顆粒的過程中酪蛋白酸鈉會包裹覆蓋于油滴表面形成球狀，使乳液顆粒帶負電，電荷絕對值越大說明體系越穩定[19]。5種沙棘果油納米乳液Ke小于15%，具有較強的離心穩定性。

表3 5種沙棘果油納米乳液的特性表征

2.3 沙棘果油納米乳液的細胞毒性

圖1為采用1號沙棘果油納米乳液樣品，以質量濃度分別為10、40、80、160、320、960、1 280、1 920、2 560、3 200 μg/mL的沙棘果油納米乳液作用HepG2細胞24 h，然后檢測細胞存活數量，以細胞存活率為縱坐標，沙棘果油納米乳液質量濃度為橫坐標制作的曲線。由圖1可以看出，樣品1作用HepG2細胞24 h后，隨著沙棘果油納米乳液質量濃度的升高，HepG2細胞存活率下降，通過擬合計算得到沙棘果油納米乳液對HepG2細胞的IC50為1 443 μg/mL。

圖2為100 μg/mL的5種沙棘果油納米乳液的細胞存活率。由圖2可知，在5種沙棘果油納米乳液的質量濃度均為100 μg/mL時，處理HepG2細胞24 h后細胞存活率能夠達到90%以上，細胞毒性小于等于10%，可視為無細胞毒性。

圖1 樣品1的質量濃度-細胞存活率曲線

圖2 5種沙棘果油納米乳液(100 μg/mL)的細胞存活率

2.4 細胞抗氧化活性標準曲線(見圖3、圖4)

圖3 不同濃度槲皮素的細胞毒性及時間-熒光值曲線

圖4 不同濃度槲皮素的CAA值

由圖3可以看出，槲皮素在0～16 μmol/L濃度范圍內處理HepG2細胞時，細胞存活率均在90%以上，表明無細胞毒性。進一步考察不同濃度槲皮素處理后，加入自由基引發劑ABAP后1 h內熒光值隨時間變化的動力學曲線，結果表明，槲皮素濃度越大，同一時刻酶標儀檢測出的熒光值越小，對自由基引發劑誘發熒光的過程抑制效果越明顯[15]。對每一條曲線進行積分，通過公式計算得到濃度范圍為0～16 μmol/L的槲皮素所對應的CAA值(見圖4)，并得到回歸方程y=18.947lnx+0.783 9(R2=0.953 7)。CAA值越大，表征抗氧化物質的細胞抗氧化活性越強，并可以通過擬合的回歸方程對抗氧化物質的細胞抗氧化活性進行定量。

2.5 沙棘果油納米乳液的細胞抗氧化活性

根據細胞毒性實驗結果，選取100 μg/mL的5種沙棘果油納米乳液和100 μg/mL的橄欖油納米乳液(GL)進行細胞抗氧化活性評價，結果見圖5。

圖5 以槲皮素定量的沙棘果油納米乳液及橄欖油納米乳液的CAA值

由圖5可知，5種沙棘果油納米乳液的CAA值分別為(171.88±11.43)、(307.71±22.19)、(238.03±10.30)、(255.24±10.83)、(310.54±21.35)μmolQE/g，橄欖油納米乳液的CAA值為(222.89±13.43)μmolQE/g。結果表明：除1號樣品外，沙棘果油納米乳液均表現出更好的細胞抗氧化活性。同時，2號和5號樣品的細胞抗氧化活性最強，1號樣品的細胞抗氧化活性最弱，可能與1號樣品的脂質伴隨物含量較少有關，有待進一步研究。

3 結 論

以食品級的酪蛋白酸鈉作為乳化劑，采用高壓均質的方法制備沙棘果油納米乳液并對其相關性質進行了研究。結果表明：沙棘果油主要脂肪酸包括棕櫚油酸、棕櫚酸、油酸和亞油酸，其中棕櫚油酸含量高達32.23%～35.24%，與一般植物油有明顯區別；總生育酚含量為188.28～244.18 mg/kg，植物甾醇含量為6 994.34～11 091.26 mg/kg，β-胡蘿卜素含量為183.25～241.25 mg/kg；制得沙棘果油納米乳液平均粒徑范圍在156.3～173.4 nm，PDI小于0.3，Zeta電位的范圍在-50.51～-57.95 mV，Ke小于15%，乳液體系均勻，穩定性良好。

在高質量濃度情況下沙棘果油納米乳液對HepG2細胞具有一定的抑制作用，IC50為1 443 μg/mL，并且100 μg/mL的5種沙棘果油納米乳液的CAA值分別為171.88、307.71、238.03、255.24、310.54 μmolQE/g，除1號樣品外，均優于相同質量濃度的橄欖油納米乳液(CAA值為222.89 μmolQE/g)，表現出良好的細胞抗氧化活性。