犬間充質干細胞在獸醫臨床的應用

胡瑭琦 ， 李秋艷 ， 鐘友剛

(1.中國農業大學動物醫學院 ， 北京 海淀 100193 ； 2.中國農業大學生物學院 農業生物技術國家重點實驗室 ， 北京 海淀 100193)

間充質干細胞是一種具有自我更新能力且能分化為其他細胞類型的細胞，因其具有較大的治療潛力，近年來在寵物疾病診療方面逐漸成為研究熱點。本文概括了利用犬間充質干細胞治療犬的幾種疾病及其研究進展，包括骨關節炎、心臟病、糖尿病、神經損傷等治愈率較低的疾病；同時對干細胞治療的現狀進行總結，為今后開展犬及其他寵物疾病干細胞治療的研究、應用提供參考依據，促進寵物診療行業的發展。

1 簡介

干細胞(Stem Cell)是一類可以進行自我復制的多能細胞[1]。根據干細胞所處的發育階段分為胚胎干細胞(Embryonic Stem Cell，ESC)和成體干細胞(Somatic Stem Cell，SSC)。成體干細胞可以從許多分化的組織中獲得，包括骨髓、脂肪和肌肉等[2]。成體干細胞又包括間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs) 和造血干細胞。

大多數研究所討論的成體干細胞實際上是間充質干細胞。從20世紀80年代開始，多個研究小組先后證實了間充質干細胞可以分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞、成肌細胞等各胚層細胞,是再生醫學領域的理想種子細胞。目前，大多數犬、貓臨床試驗使用的間充質干細胞主要為骨髓間充質干細胞(BMSCs)、脂肪間充質干細胞(ADMSCs)和臍帶血來源間充質干細胞(UCBMSCs)。

干細胞療法在近代科學研究中是一個創新領域，通過用干細胞產生的健康細胞替代組織內的受損細胞以達到治療疾病的目的[2]。干細胞療法中，成體干細胞是目前研究最多、成功率最高的細胞來源，其再生特性以及它們可改變受傷和患病組織周圍環境的能力使得許多疾病的治療成為可能。特別是間充質干細胞(MSCs)，它們易于獲得、分離和培養擴增；可以遷移到受損區域、支持其他細胞生長以及減弱機體免疫反應。有研究證實，MSCs在靜脈注射后具有向全身特別是向缺氧或損傷組織區域遷移的能力[3]；注射后也沒有發現嚴重的副作用以及腫瘤的形成[4]。近幾年，間充質干細胞療法在人類醫學上的應用效果顯著，其應用價值已經在心血管、神經學和免疫疾病的臨床試驗中得到了廣泛證實。

隨著經濟水平的提高，越來越多的人開始關注自身寵物的健康，對于寵物疾病治療的訴求日漸增加，其中犬是飼養數量最多也是寵物臨床行業最關注的種類。由于人與犬的基因序列同源性大于人與嚙齒動物的基因序列同源性，二者在生理特點和疾病(尤其是遺傳病)上都具有相似性，因此在發展人類干細胞療法的過程中，犬常被用作主要的實驗動物，這也為干細胞療法在治療犬類疾病上的應用奠定了基礎[5]。

2 間充質干細胞治療犬類疾病的應用

2.1 骨關節炎 骨關節炎(OA)是由于分解代謝和合成代謝失衡導致犬、貓出現慢性疼痛的常見原因，可導致關節軟骨和軟骨下骨的退化、侵蝕。常規治療方法如注射甾體和非甾體抗炎藥(NSAIDs)可以緩解疼痛，但不能促進其恢復。另外，NSAIDs具有腎毒性，應避免長期用藥。獸醫臨床上OA的干細胞治療試驗主要是針對犬的髖關節和肘關節，并且主要采用的是ADMSCs進行治療性試驗。Vilar 等[6]采用髖關節內單次注射ADMSCs，同時與富含生長因子(PrP)的關節內自體血小板或透明質酸(HA)一起用作軟骨保護劑，分別比較了ADSCs-PrP、ADSCs-HA和ADSCs-SVF(新鮮基質血管組分)的治療效果，結果表明，這3組對于患犬后肢功能恢復都有顯著改善。Black等[7]的一項雙盲試驗同樣表明，ADMSCs可以改善髖關節炎患犬的跛足、疼痛和運動范圍評分。

隨后，該實驗室[8]與Guercio等[9]先后證實ADMSCs還能治療犬肘關節炎。除此之外，還有學者將自體ADMSCs用于治療犬膝關節炎，結果顯示，膝關節骨贅和軟骨下囊性病變均有減輕[10]。

2.2 骨缺損 在人類和寵物，特別是犬上，干細胞療法對于改善骨折、節段性缺損、骨愈合，改良用于全關節置換的植入物以及關節融合術都有著重要的臨床意義。美國塔夫斯大學治療學實驗室先后研究了自體和同種異體BMSCs對于骨缺損的治療效果，結果發現，采用合適的生物支架結合BMSCs的治療方法，都可以增強長骨缺損中的骨再生能力，且不會發生免疫排斥反應[11-12]。

除了長骨骨缺損外，MSCs在犬下頜骨重建以及繼發于牙周病的骨吸收修復方面都具有臨床應用潛力[13-15]。因此基于MSCs的治療可以在各種臨床相關條件下改善骨形成，從而應用于獸醫臨床。

2.3 神經肌肉損傷 脊髓損傷是導致犬運動和感覺功能障礙的重要臨床疾病，通常繼發于椎間盤疾病(IVDD)以及其他退行性或創傷性原因，不僅對患犬的生活質量造成影響，也加大了主人的飼養負擔。一些研究表明，MSCs移植可以改善犬脊髓損傷試驗模型中功能性神經的恢復，Ryu等人[16]評估了同種異體ADMSCs在急性脊髓損傷犬中的植入效果，磁共振成像和神經細胞組織病理學表明：治療組相較于對照組在神經傳導速度、體感誘導電位和神經功能上均有所改善。相關文獻還對比了同種異體與自體ADMSCs對脊髓損傷后的功能恢復，結果顯示，自體ADMSCs效果更好，但二者的作用效果都明顯好于對照組[17]。Lim等[18]證明了臍帶血來源間充質干細胞(UCBMSCs)對于犬脊髓損傷也有改善作用。除了單獨使用MSCs進行治療之外，有學者將ADMSCs預先分化為神經誘導性間充質干細胞(NMSC)，將基底膜與NMSC聯合應用于脊髓損傷的犬上，結果顯示出二者共同作用對神經功能具有更好的修復效果，除了減輕損傷處炎癥反應外，還可以增加與神經元的延伸、其標志物以及神經營養因子相關的細胞因子的表達[19]。

MSCs除了有治療脊髓損傷的可能之外，還可以有效治療其他神經肌肉病變。如BMSCs可以促進犬坐骨神經損傷周圍的神經再生和功能恢復[20]；肌原分化的MSCs可治療犬杜氏肌營養不良癥等等[21]。

2.4 心臟疾病 大約10%的寵物犬患有心臟病，包括心肌梗死和擴張型心肌病[22]，這強調了開發干細胞替代療法來治療心臟病患犬的必要性。雖然MSCs分化為心肌細胞的能力存在爭議，但MSCs已被證明能顯著改善犬的心臟功能及其存活率[23-24]。

Memon等[25]將自體BMSCs直接注射到犬心臟的受損部位，4周后彩超結果顯示：治療組犬的心臟功能與對照組相比有明顯改善，這表明自體MSCs的輸入性治療手段能夠促進心肌生成和血管再生，增強心臟功能。不僅如此，另有學者將BMSCs與手術相結合治療犬心律失常，證明MSCs可以促進心房和心室肌的融合，改善傳導缺陷[26]。這些研究都為犬心臟疾病的臨床治療提供了新的可行性方案。

2.5 炎性腸病 炎性腸病(IBD)是導致犬慢性胃腸疾病的常見原因，治療方案大多是使用皮質類固醇藥物抑制機體免疫反應，然而隨著治療時間的延長，這些藥物不僅會使機體反應能力降低、臨床癥狀復發，通常還會引起不良反應[27]。Merino等[28]對12只患有IBD的犬單次靜脈注射同種異體ADMSCs，然后通過使用2種不同的臨床評分系統(包括實驗室診斷和體格檢查)，持續監測42 d后，發現2項評分的指標都有所改善。

2.6 糖尿病 在犬上，最常見的糖尿病類型為1型糖尿病，這是由于胰腺中的β細胞分泌胰島素不足導致的絕對或相對胰島素缺乏所致，最終會導致β細胞功能喪失、低胰島素血癥、葡萄糖進入細胞受損以及肝糖原異生和糖原分解的加速[29]。臨床上患犬表現多飲、多尿、多食、體重減輕的癥狀。1型糖尿病犬的β細胞功能喪失是不可逆的，終生使用胰島素治療是目前臨床上治療該病的主要措施。然而使用外源胰島素控制血糖的效果受多種因素的影響，這使得患犬的血糖容易出現大范圍波動，需要定期檢查、長期監控，這些都非常消耗獸醫與主人的時間和精力。

2012年，Kim等[30]成功將皮膚來源的MSCs誘導分化為功能性胰島素生成細胞(IPC)，為治療1型糖尿病提供了可能的β細胞來源。國內還有學者通過動脈介入技術，將導入了人胰島素(INS)基因的犬BMSCs注射到糖尿病患犬的肝內，結果顯示，該方法可以有效降低患犬血糖濃度，且肝臟病理切片也未檢測到腫瘤的形成[31]。在此技術基礎上，王麗梅等[32]將自體BMSCs移植到患犬胰腺內，結果表明：與對照組相比，治療組的胰島素使用量有所減少，在胰腺和腎臟內都檢測到了BMSCs，病理切片也未顯示任何異常改變。因此，利用MSCs的特性使機體恢復胰島素分泌功能的這種替代療法，可以作為臨床治療1型糖尿病的新思路。

3 展望

綜上所述，干細胞療法是一種較安全的方法，其中最具潛力的干細胞是MSCs，因為它們能夠促進組織修復、激活細胞因子分泌、調節機體免疫、釋放歸巢信號。通過對犬間充質干細胞的研究和臨床應用，可能為目前獸醫臨床上難以解決的病癥提供有效的治療手段，為未來寵物疾病治療提供一個新的發展方向。

雖然干細胞療法有巨大的臨床應用潛力，但有必要進一步研究證實該方法對寵物臨床患者的療效確實性。因為不同實驗室對MSCs的處理不盡相同，無法保證其同質性；對MSCs的基礎性研究也不夠系統和全面。所以制定規范的MSCs培養方案、探索其作用機制、優化臨床治療方案、避免副作用、建立寵物干細胞產品的技術標準及質量評價體系，對于MSCs廣泛應用于寵物臨床都是需要盡快解決的問題。這都需要更多優秀的科研工作者和寵物醫生對寵物干細胞進行更深入的研究，為寵物臨床奠定理論基礎，提供技術保障，從而更好更快地推進寵物行業的發展。