絲狀真菌遺傳轉化體系及篩選技術的研究進展

王越，李雅凝，曲曉磊，王旭彤

(東北林業大學林學院，哈爾濱 150040)

0 引言

絲狀真菌(Filamentous fungi)是一種廣泛分布于土壤、水域、空氣及動植物體內外等自然環境中的真核微生物，在人類的生產、生活及基礎生物學研究中具有重要地位和作用。在發酵、紡織、食品和皮革等工業中，絲狀真菌可以提高產品品質降低污染風險。如黑曲霉(Aspergillusniger)能分解飼料中的大分子糖類為單糖和寡糖，并生成多種有機酸、維生素、生物酶、生長因子，有效提高了發酵飼料的營養水平和消化吸收率。還能產生抗生素物質激發動物機體自身有益菌種的繁殖增殖，抵制有害菌群生長；在農業上，絲狀真菌具有生物防治的功能，如木霉菌(Trichodermaspp.)對多種植物病原菌有拮抗作用，往往通過競爭作用、抗生作用、重寄生作用和誘導宿主抗性等方式抑制目標病原體生長繁殖[1]；在醫藥衛生方面，絲狀真菌同樣具有重要作用，如桑黃(Sanghuangporusbaumii)作為一種珍貴的絲狀真菌，其含有的多糖、黃酮及萜類物質具有重要的藥用價值，作為主要活性物質的桑黃多糖具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調節及降血糖等多種生物活性，它可以通過提高機體免疫力而抑制腫瘤細胞的生長和轉移，還能誘發腫瘤細胞的凋亡[2]。

由于絲狀真菌的遺傳背景復雜、育種周期長以及定向性較差，傳統的育種方法(自然選擇、雜交育種)已不能滿足人們對新菌株的需求。隨著基因時代的發展，大量絲狀真菌基因組序列公布，絲狀真菌的遺傳背景逐漸清晰，其中絲狀真菌基因功能的研究漸漸成為了熱點。通過基因工程的手段在分子水平上研究絲狀真菌的基因功能以及定向改良菌種的研究報道越來越多，而構建穩定高效的遺傳轉化體系是研究基因功能和定向改造菌株的基礎。

目前關于絲狀真菌遺傳轉化的研究報道較多，轉化方法也具有多樣性，對于轉化后的絲狀真菌篩選方法也多種多樣。因此，綜述了近年來絲狀真菌遺傳轉化方法和陽性轉化子的篩選方法，為進一步研究并應用高效遺傳轉化體系提供有益參考。

1 遺傳轉化方法及轉化子檢測方法的發展與應用

1.1 遺傳轉化方法

遺傳轉化是指宿主的感受態細胞吸收了同源或外源的大分子(質粒和染色體DNA)而在遺傳性狀上發生定向改變。在絲狀真菌的轉化中，可以以菌絲體、孢子、原生質體等為受體材料，將目的基因導入宿主細胞內，使其在宿主細胞中得到穩定整合、表達并遺傳。

1.1.1 電擊轉化法。電擊轉化法是通過高壓脈沖對絲狀真菌的原生質體或細胞進行處理，使受體表面產生一個20～40 nm的電穿孔，從而使外源大分子(DNA)進入細胞內。電擊法對受體細胞產生的擾動很小，保持了受體細胞的生理活性[3]。雖然電擊法需要較昂貴的專業設備，但電擊轉化法轉化效率高、操作簡便，在許多實驗中廣泛應用。電擊法多以原生質體為受體材料，已成功獲得了草菇(Volvariellavolvacea)[4]、金針菇(Flammulinavelutipes)[5]、紫孢側耳(Pleurotussapidus)[6]靈芝(Ganodermalucidum)[7]等絲狀真菌的陽性轉化子。由于目前絲狀真菌的轉化受體多為原生質體，而對于有些真菌來說，其原生質體制備過程繁雜，再生較難，轉化效率較低，轉化子不穩定，不適合進行原生質體轉化[8]，因此電擊法在絲狀真菌中的應用具有一定局限性。

1.1.2 聚乙二醇(PEG)介導法。高國楠首創的聚乙二醇介導法是使用較早較普遍細胞融合方法，PEG是一種帶有大量負電荷的細胞融合劑，在高pH條件下，碳酸鈣可與DNA結合構成DNA-碳酸鈣復合物，PEG通過干擾細胞膜表面的電荷平衡，影響細胞間的識別，從而促進外源DNA分子進入原生質體以及細胞間融合。2004年，王強等[9]首次通過PEG轉化緩沖液將外源基因轉入靈芝(Ganodermalucidum)，并在含有100 μg/mL潮霉素的培養基上進行篩選，篩選到的轉化子通過PCR和Southern 雜交技術檢測轉化效率約為5～6個/μg (抗性轉化子/pAN7-1+107個原生質體)。目前，PEG介導法已成功構建了靈芝(Ganodermalucidum)、黃曲霉(Aspergillusflavus)[10]、產黃青霉(Pennicilliumchrysogenum)[11]、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)[12]等絲狀真菌的遺傳轉化體系。PEG介導法的轉化效率受PEG聚合度、PEG濃度和作用時間、離子種類和濃度、融合劑pH、溫度等很多因素影響。2016年，汪琪[13]等人從原生質體濃度、PEG濃度、PEG種類、轉化介質Ca2+等6個方面對PEG介導的茯苓的轉化體系進行探究，得到了最優的條件。相比于電擊法而言，PEG介導法不需要特別的儀器設備，成本較低，操作簡便。但PEG對在原生質體有一定的毒性，變異率高[14]，且由于受外部內部多種因素的影響，穩定性、重復性較差[13]，轉化率較低，因此還有待于完善。

1.1.3 基因槍介導法?；驑尳閷Хǎ纸猩飶椀兰夹g或粒子轟擊細胞法，是利用基因槍將含有目的基因的DNA溶液打入細胞，使其穿過層層細胞結構導入目的細胞核內，完成基因轉移?；驑尳閷ХㄞD化的受體材料較為廣泛，在動物、植物、葉綠體及絲狀真菌的遺傳轉化中均有廣泛應用。基因槍轉化絲狀真菌時可以以菌絲、孢子為受體材料進行轉化，無需制備原生質體，操作簡單。2005年，郭麗瓊[15]等人首次建立了草菇(Volvariellavolvacea)基因槍法遺傳轉化體系，以草菇的菌絲體為材料，獲得了8個陽性轉化子。2006年，王陽[16]等人應用基因槍法以小麥條銹菌 (Pucciniastriiformisf.sp.tritici)的夏孢子為受體材料進行了轉化，為深入研究小麥條銹菌的毒性基因及其結構的變異奠定基礎?；驑尫ň哂惺荏w材料廣泛、操作簡單等優點，但是基因槍介導法需要專門的實驗儀器，耗材也很昂貴，成本較高，多拷貝整合還可能發生共抑制[17]，轉化率相對較低。

1.1.4 限制性酶介導的整合法。限制性內切酶介導的整合法(REMI)是指在線性的質粒和相應的限制性內切酶的作用下轉化絲狀真菌的原生質體[18]，限制性內切酶進入受體細胞后，識別受體DNA上特異的位點并進行切割，產生的粘性末端可以質?；パa相連，質粒DNA 通過堿基配對插入受體細胞的基因組，從而成功實現轉化。限制性內切酶介導的轉化技術具有定向性強、轉化效率高、適用范圍廣等特點。2007年，周慶新[19]利用限制性內切酶介導的整合技術轉化尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosus)，最后獲得了20株尖孢鐮刀菌轉化子，而沒有得到嗜熱絲孢菌的轉化子。由于影響REMI轉化的因素有很多，如原生質體的制備、質粒和限制性內切酶的選擇都會影響轉化率，作者分析試驗選用的質粒pUCATP攜帶的A.nidulans的PtrpC啟動子不能在嗜熱菌中起作用從而無法調控潮霉素磷酸轉移酶基因(HPT)基因表達。2010年，江蓓蓓[20]等以玉米彎孢霉葉斑病菌(Curvularialunata)WD-1的原生質體為實驗材料，將含有HPT的質粒pUCATPH進行限制酶介導的整合轉化，成功獲得了陽性轉化子，并在培養基上培養發現轉化子的產孢量和生長速度明顯慢于野生菌株，這為玉米彎孢霉葉斑病菌的防治提供了有意義的線索。酶介導法雖然定向性強，范圍廣，但是酶的種類和濃度對轉化效率影響很大，這大大限制了酶介導方法的使用。

1.1.5 根癌農桿菌介導法。根癌農桿菌是一種革蘭氏陰性細菌，在自然界中，農桿菌通過侵染受體傷口進入細胞后，Ti質粒上的Vir基因區域和T-DNA區域共同作用，將T-DNA高效率地整合到宿主的基因組上并進行表達。因此，人們選擇將外源目的基因插入到質粒的T-DNA區域，通過農桿菌的感染將外源基因整合到宿主細胞的染色體上，培養得到轉化子。根癌農桿菌介導的遺傳轉化法(ATMT)最初是由 Bundock[21]在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中開始應用的，隨后該方法被用于進行多種絲狀真菌的研究。1998年de Groo[22]利用根癌農桿菌，以原生質體、分生孢子和菌絲體為受體材料成功轉化了多個絲狀真菌，黑曲霉(Aspergillusniger)、云孢鐮刀菌(Fusariumvenenatum)、瑞士木霉(Trichodermareesei)、黑木耳炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)等。2000年，Chen等[23]首次以雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)的菌褶組織為受體材料，利用農桿菌介導轉化法實現了雙孢蘑菇的遺傳轉化。目前在食用菌中已有很多物種進行了遺傳轉化體系的構建，比如雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)、金針菇(Flammulinavelutipes)、草菇(Volvariellavolvacea)等[24]。相對于其他的絲狀真菌遺傳轉化方法，農桿菌介導的絲狀真菌的轉化具有操作簡便、受體廣泛、轉化效率高、單拷貝插入和遺傳穩定等優勢[25]。但根癌農桿菌介導的轉化受很多因素影響，如選用的根癌農桿菌菌株類型、受體材料、二者共培養的時間和濃度以及篩選轉化子需要的抗生素的種類等。其次，根癌農桿菌介導法對載體要求較高，攜帶T-DNA的雙元表達載體的構建過程較為復雜[26]，同時研究發現T-DNA的插入具有偏好性，而且可能打斷宿主原有的基因或引起染色體重排，從而改變了宿主的表型。2013年，俞咪娜[27]等人在對稻曲病菌突變體5062的研究中發現突變體菌與野生菌的表型有顯著差異，而且T-DNA插入引起了稻曲病菌的染色體重排現象，從而推測突變體5062的表型發生變化是T-DNA插入和染色體重排共同作用的結果。

1.2 絲狀真菌轉化子的檢測技術

絲狀真菌的遺傳轉化系統的建立通常以載體為基礎，將改造的載體通過各種轉化方法轉入受體細胞內，從而使載體上的目的基因在宿主細胞中進行擴增和表達。由于目前遺傳轉化的效率較低，在轉化過程中，不是所有的宿主細胞都一定被轉化，也不是所有的轉化細胞中一定含有目的基因。因此，在絲狀真菌進行基因轉化后，外源基因是否進入絲狀真菌細胞，并整合到染色體上，整合的外源基因是否能夠穩定表達是研究絲狀真菌遺傳轉化系統的重中之重。所以準確快速鑒定轉化子對絲狀真菌遺傳轉化體系構建具有重要的意義。

1.2.1 以基因為基礎的檢測技術

1.2.1.1 PCR鑒定：聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)是1985年創立的一種在體外模仿DNA的天然復制的分子生物學技術，具有周期短、操作簡便、靈敏度高、特異性強的特點，在遺傳轉化子的鑒定中應用廣泛。在絲狀真菌轉化子檢測中，我們通常以轉化子的單個克隆為模板，利用特異性引物或通用引物對轉化子中的目的基因進行PCR擴增，從而鑒定和篩選陽性轉化子。目前常用的檢測基因有GUS基因，GFP基因，HPT基因等。但由于PCR擴增有時得到的產物特異性較差，會出現假陽性擴增，因而對轉化子的陽性檢測還需要其他方法進一步鑒定。

1.2.1.2 Southern 印跡雜交鑒定：Southern印跡雜交是1975年英國人Southern發明的一種研究DNA圖譜的基本技術，利用電泳分離的待檢測的靶單鏈DNA與標記的單鏈核酸探針進行雜交，從而判斷待檢測的DNA樣品中是否有與探針同源的片段以及該片段的長度。2006年，應盛華等[28]對球孢白僵菌(Beauveriabassiana)孢壁蛋白相關的耐熱分子機理進行了研究，并且建立了基于球孢白僵菌芽生孢子的新型遺傳轉化體系。應盛華等人挑選了10個轉化子進行Southern雜交鑒定，有2個轉化子顯示出雜交帶。2012年，師亮等[29]首次建立了根癌農桿菌介導的靈芝遺傳轉化系統，提取了轉化子的DNA進行了Southern blot檢測，轉化子均顯示陽性雜交信號。Southern雜交技術能夠防止操作污染和質粒轉化殘留所引起的假陽性的信號出現[30]，具有特異性強，靈敏性高的特點，是檢測外源基因導入的重要手段。隨著Southern雜交技術的不斷發展，逐漸成熟，其越來越多地被應用到絲狀真菌基因工程基礎研究中。

1.2.1.3 Northern 印記雜交鑒定：Northern 印記雜交鑒定是指將提取的轉化子的總RNA或mRNA用變性凝膠電泳分離后，轉移到固相支持物上，用探針與膜雜交，然后通過探針的標記性質來鑒定其中特定mRNA分子的含量及其大小。2006年，于寒穎等[31]為了對核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)arom基因進行功能驗證和相應蛋白的研究，構建了酵母表達載體pYES2-arom并將其導入釀酒酵母H158 (SaccharomycescerevisiaeH158) 中，對轉化子進行Northern雜交結果顯示，核盤菌arom基因在釀酒酵母胞內成功表達。Northern印跡雜交技術是一種快速檢測和篩選陽性克隆片段的方法，并具有簡便、經濟的優點，在動物和植物轉基因檢測方面應用廣泛。隨著分子生物學技術的發展，對Northern blot技術優化的相關研究也越來越多。在Northern blot中最為常用的電泳膠是含有甲醛的瓊脂糖凝膠，但甲醛具有較強的毒性，2004年，胡盛平[32]等通過改良，建立了安全無毒RNA凝膠電泳法，其次他們還簡化了RNA的轉印過程。此外，Northern blot需要提取RNA，但由于RNA極易受外界環境因素特別是核糖核酸酶的影響，其次在絲狀真菌中，由于復雜的細胞壁和內源酶活性以及干擾RNA提取的多糖等物質的存在，從絲狀真菌中提取和純化出有生物活性的RNA比較困難。因此Northern雜交在絲狀真菌的轉化子鑒定中應用較少。

1.2.1.4 轉化子DNA測序：DNA測序是指分析特定DNA片段的堿基序列，即檢測腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶與胸腺嘧啶的排列方式。由于DNA測序技術的不斷發展，為了更準確的鑒定轉化子為目的克隆，我們通常會利用PCR、核酸雜交技術鑒定之后，從陽性克隆中挑選幾例轉化子進行DNA測序，以便再次確認是否轉化成功。2015年，丑天勝等[33]通過高通量測序技術對金針菇(Flammulinavelutipes)的一個RNAi轉化子菌株1382R3進行了DNA測序，成功檢測到了外源載體DNA在基因組中的插入位點和拷貝數量。2017年，崔月貞[34]等采用PEG誘導原生質體轉化的方法，將綠色熒光蛋白基因(GFP)轉化到球炭疽病菌(Colletotrichumcoccodes)中，轉化子經測序表明GFP基因已整合至球炭疽菌基因組DNA中。DNA測序技術的迅速發展，以高通量、低成本為特點的二代測序技術得到了充分的發展與應用，是一種科學、可靠的方法，但是對轉化子逐一測序，所需的工作量大，費用比較高。2020年，劉媛媛[35]等應用矩陣設計對金針菇的轉化子進行測序，大大節省了測序費用、提高效率，并且準確檢測出其插入位點和拷貝數。

1.2.2 以蛋白質為基礎的檢測技術

1.2.2.1 營養缺陷型篩選：營養缺陷型菌株與野生型菌株相比失去了合成某些代謝物如氨基酸、維生素的能力，只能在完全培養基或補充了相應的生長因子的基本培養基中才能正常生長。在構建絲狀真菌遺傳轉化體系的過程中，只有轉化子可以在不含該種成長因子的培養基中生長。營養缺陷型標記基因來自宿主本身，有利于基因表達，易于篩選，在大多數絲狀真菌的遺傳轉化中應用廣泛。1973年，Mishra等首次利用肌醇缺陷型粗糙脈孢菌(Neurospora)進行轉化實驗[36]。目前，營養缺陷型篩選標記在酵母菌、絲狀真菌以及少數細菌中已經得到應用。1979年, Botstein[37]和Struhl[38]以編碼乳清苷5-磷酸脫羧酶的基因(ura3)作為選擇標記構建釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)轉化系統。這類篩選標記在構巢曲霉(Aspergillusnidulans)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)等科學研究模式菌， 以及釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和畢赤酵母(pichiapastoris)等基因高效表達體系應用最為成功。在絲狀真菌的遺傳轉化中，尿嘧啶營養缺陷型是一種常用的營養缺陷型標記。2019年，周陳力[39]等人采用紫外光誘變、單單雜交、孢子單核化的方法從靈芝單核體菌株出發，成功得到尿嘧啶營養缺陷型雙核體菌株，為靈芝遺傳轉化體系的構建提供了材料。營養缺陷型菌株在科學研究領域有重要作用，但部分絲狀真菌營養缺陷型菌株不易獲得，給營養缺陷型的篩選帶來麻煩。

1.2.2.2 抗性基因篩選：抗性基因篩選是指在構建絲狀真菌遺傳轉化體系時，常常選擇帶有抗生素抗性基因的載體轉入受體菌株，而后在含有該抗生素的培養基上幫助篩選出已轉化的細胞。相比于營養缺陷型篩選，抗性基因篩選對受體菌沒有特定的要求，操作起來比較簡單方便。但由于不同菌株對不同種類和濃度抗生素的敏感性不同，因此，篩選出合適的抗生素濃度種類和濃度對轉化子的鑒定具有重要意義。目前，被廣泛應用的抗生素類標記基因包括氨芐青霉素抗性基因，氯霉素抗性基因，鏈霉素抗性基因，四環素抗性基因，卡那霉素抗性基因，潮霉素抗性基因等。其中，以HPT作為篩選基因的研究最為廣泛。2010年，董曉雅等[40]在利用PEG-CaCl2介導原生質體轉化的方法構建平菇(Pleurotusostreatus)遺傳轉化體系的研究中，將含有HPT的載體轉入平菇，轉化子經過80 μg/mL潮霉素初篩和100 μg/mL潮霉素復篩，獲得了具有潮霉素抗性的陽性轉化子。2017年，張昕[41]等在研究金針菇免疫調節蛋白基因(FIP-fve)對金針菇本身的生物學功能時，構建了帶有HPT的FIP-fve基因沉默載體，并利用農桿菌介導法將其轉入金針菇菌絲，將轉化后的金針菇菌絲塊置于含有潮霉素(9 μg/mL)的培養基上培養，共得到5個金針菇陽性轉化子。使用藥物抗性相比于營養缺陷型標記更簡單，不需要受體具有營養缺陷型，因此抗性基因篩選在絲狀真菌的轉化中應用更加廣泛。但使用藥物篩選易導致菌株產生耐藥性，抗性較為不穩定，只能在初篩和復篩中應用，對于抗性篩選出的轉化子，仍需要應用其他檢測方式鑒定基因是否整合到真菌基因組中。

1.2.2.3 報告基因檢測：報告基因是一類用于檢測組裝的嵌合基因在導入受體細胞后是否具有功能的指示基因，通常把目的基因與報告基因組裝成嵌合基因，通過檢測它的表達產物來判斷外源目的基因是否成功整合進宿主細胞。作為報告基因，在遺傳選擇和篩選檢測方面必須具有以下幾個條件：①表達產物具有相對的穩定性，很容易被檢測；②表達產物在受體細胞中本不存在，或僅存微量的相似的內源性表達產物；③報告基因的表達對受體細胞無影響。最常用的報告基因大多是編碼抗生素抗性蛋白的基因、β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)、氯霉素乙酰轉移酶基因(CAT)、熒光素酶基因、熒光蛋白家族等。其中CAT是真核基因表達調控中最早使用的報告基因之一[42]，但由于其具有放射性，與其他報告基因相比線性范圍較窄，靈敏性較差；熒光素酶基因雖然操作簡單、靈敏度高，但是其所需要的檢測儀器較貴；熒光蛋白家族包括綠色、紅色、黃熒光蛋白等，其中綠色熒光蛋白(GFP)是應用最多的一種。2008年，王曉利等[43]建立農桿菌介導的瑞士木霉(Trichodermareesei)轉化體系中GFP作為標記基因，通過熒光顯微鏡下對轉化子進行熒光觀察，結果顯示在瑞氏木霉菌絲和孢子中都可以觀察到強烈的綠色熒光。2016年，祁浩等[44]利用GFP基因驗證了所構建的綠色熒光蛋白釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表達載體具有便捷篩選及良好的表達效果。GFP基因在絲狀真菌的研究中廣泛應用，是一種良好的標記物，其表達對寄主細胞無毒性作用，并且易于檢測，只需要紫外光或藍光激發，就可觀察到綠色熒光。除GFP基因之外，GUS基因存在于一些細菌基因組內，在真菌中很少或完全檢測不出GUS活性，而且GUS報告基因的檢測僅需簡單的化學反應即可肉眼觀察到，因此GUS基因在分子生物學研究中使用頻率更高。2012年，徐志超等[45]用香菇三磷酸甘油醛脫氫酶(GPD)啟動子構建了載體p1305.1-GPD，以GUS基因為報告基因，通過根癌農桿菌介導將載體轉入靈芝(Ganodermalucidum)細胞內，轉化子在GUS染色后呈現明顯藍色，表明GUS可以作為篩選靈芝轉化子的報告基因。2012年，師亮[29]等在靈芝(Ganodermalucidum)中分別構建了EGFP和GUS報告基因表達載體， 通過對轉化子的檢測表明GUS在靈芝中更加敏感。目前利用報告基因來檢測轉化子已經是一種廣泛應用的手段，但是報告蛋白的半衰期較長，影響了基因表達的實時監測，以及報告基因的靈敏度、檢測方法的容易程度、檢測所需的費用等仍是我們應該考慮的問題[42]。

1.2.3 生物學鑒定。除了利用分子生物學技術從基因層面進行轉化子的鑒定之外，轉化子和野生型菌株在一些生物學特性方面也有明顯差異。2010年，董曉雅[40]等在構建平菇(Pleurotusostreatus)遺傳轉化體系時，首先利用潮霉素對轉化子進行初篩和復篩，發現陽性轉化子菌絲較為濃密，生長速度快，而假陽性轉化子菌絲則相對稀疏，生長速度慢。2016年，柏英等[46]在研究通過農桿菌介導的同源重組的方法構建的黑曲霉(Aspergillusniger)ras基因敲除子時，從生長速度、菌絲形態及產孢情況、生長溫度、生物量等生物學特性方面對敲除子進行了研究。研究發現，轉化子的生長速度比野生型慢，而且菌絲致密、顏色較深同時轉化子邊長菌絲邊產孢。2017年，孫佳瑩[47]等以根癌農桿菌介導法構建了玉米北方炭疽病菌(Aureobsidiumzeae)的遺傳轉化體系，通過該體系獲得了5種轉化子，并將野生型的菌落特征和5種轉化子一并進行了比較，結果發現轉化子在菌落顏色、生長速度、革質化及產孢量等方面都有一定變化。2019年，宋燕嬌[48]等在采用PEG介導的原生質體轉化法陰環炭團菌(Annulohypoxylonstygium)TJAS01的糖轉運蛋白編碼基因TJAS01-V10012900進行敲除的研究中，發現轉化子在生長速度、菌落形態特征方面與野生型菌株相比具有明顯差異。通過形態學觀察、生物量測定的等生物學鑒定來篩選轉化子更加直觀，操作簡單，可以作為分子生物學鑒定手段的輔助手段加以利用。

2 總結和展望

絲狀真菌作為一種在工業、農業、醫藥衛生領域具有廣泛應用前景的微生物，對其基因功能的研究尤為重要。近年來發展了許多真菌基因功能研究方法，如轉座子標簽技術、基因敲除技術、基因過表達技術等，這些技術的研究主要以真菌的遺傳轉化為基礎。目前絲狀真菌的遺傳轉化主要存在以下幾個方面的問題，轉化率低、篩選鑒定不夠快速準確、操作較為復雜。

2.1 轉化率低

絲狀真菌的遺傳轉化效率與所選用的轉化方法、受體材料以及質粒載體的選擇密切相關。如PEG介導法、電擊法或限制性內切酶法多以原生質體作為受體材料，因此原生質體的再生是影響轉化率的一個重要因素。原生質體再生率受到各種條件的影響，如菌齡、酶濃度、酶解溫度、預處理等的影響，提高原生質體的再生率是提高轉化率的關鍵因素。對于部分絲狀真菌而言，原生質體制備過程繁雜，再生較難，我們可以嘗試以菌絲體、孢子為受體材料進行轉化。根癌農桿菌介導的轉化可以不制備原生質體，操作簡便，轉化效率相對較高，是絲狀真菌遺傳轉化中較為常用的方法。但在根癌農桿菌介導的轉化中，農桿菌菌株的類型、乙酰丁香酮的濃度、共培養的條件等也對轉化效率有影響。此外，外源基因在受體菌中表達還與所選用的載體有關，不同的載體類型以及驅動外源基因表達的啟動子對轉化效率也有較大的影響。2012年，師亮[29]構建靈芝的遺傳轉化體系時發現，內源啟動子能夠顯著提高轉化效率。

2.2 篩選鑒定不夠快速準確

在多種絲狀真菌的轉化子鑒定方法中，抗生素篩選是最直觀的篩選轉化子方法，但是假陽性率較高；PCR鑒定檢測速度快、成本較低，但是在轉化子中也會存在一定的假陽性；Southern雜交操作較為復雜、成本較高，但是特異性強、靈敏度高。因此在遺傳轉化研究中，常常將3種方法結合鑒定陽性轉化子可以節約試驗時間、降低試驗成本，并且檢測更靈敏。此外，熒光蛋白基因作為篩選標記具有熒光穩定、易于檢測、對細胞無毒害、無物種特異性和無需底物等特點，也經常與PCR鑒定相結合，但由于一些真菌菌絲自身帶有熒光，所以不適用于所有絲狀真菌。因此針對不同的真菌綜合選用合適的篩選方法對陽性轉化子的篩選具有重要意義。

2.3 操作較為復雜

我們現有的轉化方法有些需要特定的設備才能進行，如基因槍介導法。其他的幾種轉化方法也需要篩選出合適的轉化條件。另外原生質體的制備也是一個比較復雜的過程，因此，改良絲狀真菌原生質體制備和再生的手段，或者嘗試以孢子或其他受體材料進行轉化，可能會使轉化更加簡單高效。

絲狀真菌作為一種具有較高經濟價值的菌類，遺傳研究開展得較晚，相信隨著分子生物學手段的不斷改進和創新，絲狀真菌的遺傳轉化體系的建立將越來越精確、高效。進一步加深對現有轉化方法的研究，如T-DNA在絲狀真菌中的插入和整合機制，或綜合多種轉化方法共同進行轉化，這對構建絲狀真菌轉化體系，研究其基因功能以及絲狀真菌的改造具有重要的意義。