華山松籽油亞油酸的富集純化及降血脂活性研究

郭劍霞，張謹華，潘玉峰，溫 學

(晉中學院 生物科學與技術(shù)學院， 山西 晉中 030619)

隨著人們生活水平的提高，高血壓、高脂血癥等營養(yǎng)性疾病的發(fā)生率呈上升趨勢，成為威脅人類生命健康的主要疾病。目前，臨床上常采用藥物治療和飲食干預的方法控制和降低血脂水平。但是藥物治療費用相對較高，且存在不同程度的副作用。飲食控制雖然能夠在一定程度上起到調(diào)節(jié)機體內(nèi)脂質(zhì)代謝的作用，但往往長期控制效果欠佳。相比之下，食用降血脂功能性食品可能是長期控制血脂更理想的方法，開發(fā)純天然的功能性降血脂食品是目前的研究熱點[1-2]。

華山松籽仁為松科植物華山松(Pinusarmandifranch)的果仁，系我國特產(chǎn)，華山松籽含油量高達50%～60%，其油中亞油酸含量最高，達57.7%。亞油酸作為重要的功能性多不飽和脂肪酸，具有重要的生理作用和藥用價值[3-5]。亞油酸有助于降低人體內(nèi)血清膽固醇含量，使機體高密度脂蛋白膽固醇升高，減少脂質(zhì)在血管壁上的沉積，防止動脈血栓的形成，使血管壁功能得到提高和完善[6-7]。我國華山松籽資源豐富,而目前關于華山松籽油的研究報道較少。從華山松籽油中富集純化亞油酸，開展對華山松籽油功能成分的開發(fā)與研究對生產(chǎn)具有保健功能的油脂具有重要意義。

目前，對亞油酸的富集純化方法主要有尿素包合法[8]、低溫結(jié)晶法[9]、分子蒸餾法[10]和超臨界CO2萃取法等[11-13]。其中，尿素包合法主要依據(jù)長鏈脂肪酸的不飽和度進行分離，尿素本身具有充實的四方晶系，當其在有機溶劑中遇到脂肪族化合物時，尿素分子間會通過強大的氫鍵力以右旋方式在有機物分子的周圍沿棱柱邊螺旋上升，形成寬大的六方晶體。直鏈飽和脂肪酸因其分子能自由旋轉(zhuǎn)，位置取向較多，故最易與尿素形成穩(wěn)定包合物，而不飽和脂肪酸中的雙鍵限制分子旋轉(zhuǎn)，造成空間位阻大，不易被包合，從而可得到較高純度的多不飽和脂肪酸。尿素包合法分離效果好,設備簡單、操作方便,適合工業(yè)化生產(chǎn)[14-15]。

本研究通過單因素試驗初步優(yōu)化了尿素包合法富集純化亞油酸的工藝，同時以昆明小鼠為研究對象，考察華山松籽油中亞油酸對高脂小鼠的血脂調(diào)節(jié)作用，以期為華山松籽油在高脂血癥患者的飲食輔助治療提供重要的參考價值，對控制高脂血癥的發(fā)病率及促進華山松籽的深度開發(fā)有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

華山松籽油，由吉林省派諾生物技術(shù)有限公司的華山松籽仁經(jīng)超臨界CO2萃取制得；清潔級健康昆明種小鼠(雄性，體重 18～22 g)，山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供；基礎飼料，山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供；高脂飼料(配方為86.5%基礎飼料，5.8%蛋黃粉，0.5%膽固醇，7%豬油，0.20%牛膽酸鈉)；尿素、無水硫酸鈉、95%乙醇、石油醚、甲醇、硫酸、鹽酸、氫氧化鉀等，均為分析純；正己烷，色譜純；混合脂肪酸甲酯標準品(純度>99.5%)，購于美國Sigma公司；甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等測定試劑盒，購于南京建成生物工程研究所。

RE-5203A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，PHS-3C型酸度計，日本島津GC2010氣相色譜儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 混合脂肪酸的制備

參考文獻[16]中的方法。稱取50 g華山松籽油于燒瓶中，加入300 mL 4%的氫氧化鉀-95%乙醇溶液，用磁力攪拌器緩慢攪拌升溫至75℃，皂化回流2.0 h 至皂化完全。加入適量的溫水，繼續(xù)攪拌 0.5 h，使形成的皂化物充分溶解。用 20%的鹽酸調(diào)節(jié) pH 約為 2，繼續(xù)攪拌 15 min。倒入分液漏斗中，靜置分層，去掉下層的水層。加入適量石油醚(沸程30～60℃)萃取，用溫水洗滌至中性，加入無水硫酸鈉脫水，抽濾，濾液經(jīng)旋蒸除去石油醚，得到混合脂肪酸。

1.2.2 尿素包合法純化亞油酸

參考文獻[16]中的方法。將95%乙醇與尿素按照一定比例加入燒瓶中，水浴加熱，攪拌，待尿素完全溶解后，按照與尿素一定的比例加入混合脂肪酸，回流 40 min。將溶液倒入錐形瓶中，冷卻至室溫后轉(zhuǎn)入低溫包合一定時間。減壓抽濾，濾液旋蒸除去乙醇，溫水洗滌，用 20%的鹽酸調(diào)節(jié) pH 約為2，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入石油醚(沸程30～60℃)萃取，用溫水洗至 pH 為 7 后，加入無水硫酸鈉脫水，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去石油醚，即得產(chǎn)品亞油酸。亞油酸得率=產(chǎn)品亞油酸質(zhì)量/混合脂肪酸質(zhì)量×100%。

1.2.3 亞油酸含量的測定

1.2.3.1 脂肪酸甲酯的制備

取樣品0.1 g于燒瓶中，加入2 mL 1%硫酸-甲醇溶液，于75℃的水浴中反應1 h。反應結(jié)束后分別加入2 mL生理鹽水和2 mL正己烷，振蕩，靜置分層后取上層正己烷相，加入無水硫酸鈉離心(4 000 r/min，20 min)，吸取上清液置于棕色瓶中-20℃保存，待氣相色譜分析。

1.2.3.2 脂肪酸含量測定

采用氣相色譜儀測定亞油酸含量，面積歸一化法定量。氣相色譜條件：CBP-20毛細管色譜柱(50 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫為初始溫度180℃，以6℃/min的速度升至240℃，保持40 min；進樣口溫度和檢測器溫度均為280℃；FID檢測器；載氣為高純氮氣，流速30 mL/min；氫氣流速47 mL/min；空氣流速400 mL/min；進樣量1 μL。

1.2.4 華山松籽油純化亞油酸(PAFL)降血脂試驗

1.2.4.1 高脂模型建立及動物分組和飼喂安排

選取健康雄性昆明小鼠 50 只，小鼠自由飲水，基礎飼料飼喂1周后，按體重和總膽固醇含量(TC)平均分配原則將小鼠分成正常對照組、高脂模型組、PAFL低劑量組、PAFL中劑量組、PAFL高劑量組，每組 10 只。正常對照組小鼠飼喂基礎飼料，其他組小鼠飼喂高脂飼料，PAFL低、中、高劑量組分別灌胃PAFL 1.7、3.5、5 mL/(kg·d)。各試驗組小鼠每天每只灌胃 0.4 mL 生理鹽水，自由飲水，自然光照，飼喂28 d。飼喂期間，每天保持充足的食物和飲水，期間每天記錄小鼠的體重和攝食量。在飼喂14 d后，從正常對照組和高脂模型組(用高脂飼料誘導而不加用受試物的小鼠) 中隨機選 6 只小鼠，經(jīng)眼球取血，分離血清，根據(jù)試劑盒的說明方法測定其TC、TG和HDL-C 以判斷模型是否建立成功。經(jīng)測定小鼠血清TC、TG水平明顯升高，HDL-C水平明顯降低，表明小鼠高脂模型構(gòu)建成功。

1.2.4.2 小鼠血脂指標測定及動脈硬化指數(shù)計算

小鼠飼喂 28 d 禁食 12 h，眼眶靜脈叢采血，4℃冰箱靜置 3 h，離心(3 000 r/min，15 min，4℃)，取血清，試劑盒測定小鼠血清中的 TC、TG、LDL-C和HDL-C水平。同時計算動脈硬化指數(shù)(AI)(動脈硬化指數(shù)=(TC含量-HDL-C含量)/HDL-C含量)。

1.2.4.3 小鼠肝臟重及肝臟指數(shù)的測定

小鼠連續(xù)灌胃28 d，在末次灌胃 24 h 后，稱量體重，立即摘取肝臟，生理鹽水沖洗，濾紙吸干后稱重，計算肝臟指數(shù)(肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量/小鼠最終體質(zhì)量)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel 進行整理，結(jié)果以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 尿素包合法分離純化亞油酸條件優(yōu)化

2.1.1 包合時間對純化的影響

在包合溫度-5℃、混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比值 0.3、95%乙醇與尿素體積質(zhì)量比值4的條件下，考察包合時間對亞油酸純度和得率的影響，結(jié)果見圖 1。

圖1 包合時間對亞油酸純度和得率的影響

由圖 1 可知，包合時間在 6～24 h 范圍內(nèi)，隨著包合時間的延長，亞油酸純度和得率逐漸增加，當包合時間為 24 h時，結(jié)晶過程基本完成，亞油酸純度與得率最佳。再延長包合時間，亞油酸得率略有下降。這可能是由于包合時間較短時，軟脂酸、油酸等飽和脂肪酸及單不飽和脂肪酸并未與尿素充分形成包合物或是包合還未達到飽和，故延長包合時間反應向正向進行，生成物增加，亞油酸純度提高，繼續(xù)延長包合時間，少量的尿素以晶體形式析出，而尿素包合過程中存在包合和解包合的動態(tài)平衡，尿素晶體的析出使得反應向解包合的方向進行，尿素晶體數(shù)量和體積增加，在抽濾的過程中，會攜帶少量的亞油酸，導致亞油酸的得率反而下降。綜合考慮，選擇包合時間為 24 h。

2.1.2 包合溫度對純化的影響

在混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比值0.3、包合時間24 h、95%乙醇與尿素體積質(zhì)量比值4的條件下，考察包合溫度對亞油酸純度和得率的影響，結(jié)果見圖 2。

圖2 包合溫度對亞油酸純度和得率的影響

由圖 2可見，隨著包合溫度升高，亞油酸得率逐漸增加，但純度降低。這是因為尿素包合為放熱反應，低溫有利于包合反應的進行并有助于形成穩(wěn)定的包合物。在形成尿素包合物時體系放熱，反應隨溫度降低朝正向進行，進而快速形成包合物晶體便于分離，而當溫度過低時，雖然濾液中亞油酸純度得到提高，但影響亞油酸得率。綜合考慮，當包合溫度為-10℃時，亞油酸純度和得率均較為理想，為最適包合溫度。

2.1.3 混合脂肪酸與尿素的質(zhì)量比值對純化的影響

在包合溫度-10℃、包合時間24 h、95%乙醇與尿素體積質(zhì)量比值4條件下，考察混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比值對亞油酸純度和得率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比值對亞油酸純度和得率的影響

由圖3可見，隨著混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比值的增加，亞油酸的純度下降，得率上升。當混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比值小于0.4時，隨著混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比值的增加，亞油酸得率上升，當混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比值大于0.4時，亞油酸得率基本保持不變。這是因為尿素分子在結(jié)晶過程中能夠與飽和脂肪酸或單不飽和脂肪酸形成較穩(wěn)定的晶體包合物析出，而多不飽和脂肪酸由于雙鍵較多，碳鏈彎曲，具有一定的空間構(gòu)型，不易被尿素包合。當尿素用量過多時，一部分亞油酸隨尿素形成的包合物析出，得率降低；而當尿素用量過少時，飽和脂肪酸或單不飽和脂肪酸未能被全部包合，有一部分還在有機相中，導致亞油酸的分離效果不佳，純度偏低。綜合上述因素，混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比值0.4為尿素包合時最佳比例。

2.1.4 95%乙醇與尿素的體積質(zhì)量比值對純化的影響

在包合溫度-10℃、包合時間24 h、混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比值0.4的條件下，考察95%乙醇與尿素體積質(zhì)量比值對亞油酸純度和得率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 95%乙醇與尿素體積質(zhì)量比值對亞油酸純度和得率的影響

溶劑在包合過程中主要起到溶解尿素的作用，甲醇有毒，考慮到毒性、溶解度等因素，經(jīng)預試驗選用95%乙醇作為溶劑。當尿素完全溶于溶劑中并達到飽和狀態(tài)時，為包合效果最佳。由圖4可見，95%乙醇與尿素體積質(zhì)量比值較小時，亞油酸純度和得率也較低。這是因為當95%乙醇與尿素體積質(zhì)量比值過小時，乙醇用量較少，尿素無法充分溶解，溶液較黏稠，分子運動阻力增大，包合反應不充分，使亞油酸純度較低，且亞油酸在尿素晶體表面黏附，導致亞油酸的得率偏低。隨著95%乙醇與尿素體積質(zhì)量比值的增加，亞油酸的純度和得率均緩慢升高。這可能是因為隨著溶劑增多，脂肪酸溶解度也在逐漸增大，從而產(chǎn)品得率得以提高，且使尿素對飽和脂肪酸以及單不飽和脂肪酸結(jié)合能力變強，亞油酸純度得到了提高。當95%乙醇與尿素體積質(zhì)量比值過大時，使尿素包合逆反應加速，對飽和、單不飽和脂肪酸的包合程度下降，導致亞油酸純度降低。綜合考慮，95%乙醇與尿素體積質(zhì)量比值為5時，亞油酸純度及得率均較為理想，為95%乙醇與尿素的最佳體積質(zhì)量比值。

2.2 尿素包合法富集純化的華山松籽油亞油酸純度

由單因素試驗確定尿素包合法分離純化亞油酸最佳工藝條件為: 混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比值0.4，95%乙醇與尿素體積質(zhì)量比值 5，包合時間 24 h，包合溫度-10℃。在最佳工藝條件下進行3次平行驗證試驗，得到產(chǎn)品亞油酸的平均純度為80.57%。亞油酸含量由原來的57.66%增加到80.57%，說明尿素包合法有效地富集了華山松籽油中的亞油酸。

2.3 華山松籽油中亞油酸功能評價

2.3.1 對小鼠體重的影響(見圖5)

圖5 PAFL對小鼠體重的影響

在整個飼喂期間，試驗組小鼠毛色光潔，食欲正常，均未出現(xiàn)異常體征，未發(fā)生自然死亡。由圖5可見，與模型組相比，華山松籽油純化亞油酸(PAFL)并沒有改變小鼠體重的變化趨勢，在給小鼠連續(xù)灌胃 28 d 不同劑量的華山松籽油純化亞油酸(PAFL)之后，小鼠體重雖高于正常對照組，但低于高脂模型組，且小鼠體重隨灌胃劑量的增加而明顯降低。說明PAFL有降低高脂小鼠體重的作用。

2.3.2 對小鼠肝臟重及肝臟指數(shù)的影響(見圖6)

圖6 PAFL對小鼠肝臟重與肝臟指數(shù)的影響

長期食用高脂飼料可導致受試動物肝臟脂質(zhì)積累及病變，這可通過肝臟指數(shù)來反映。由圖6可見，在給小鼠連續(xù)灌胃 28 d 不同劑量華山松籽油純化亞油酸(PAFL)之后，小鼠肝臟重與肝臟指數(shù)雖然高于正常對照組，但低于高脂模型組。灌胃一定劑量的PAFL可以起到延緩高脂血癥小鼠的肝臟重與肝臟指數(shù)增高的作用，并且肝臟重與肝臟指數(shù)隨著灌胃劑量的增加而明顯降低。肝腫大的特征是肝細胞過氧化體顯著增加，降脂藥長期致癌性的一項指標就是過氧化體的增生。目前許多降脂藥物在服用后會明顯地使肝臟增重、腫大[17]。本試驗3個劑量組小鼠的肝臟指數(shù)均比高脂模型組小，不至于使肝臟腫大。因此，相比之下，華山松籽油純化后亞油酸顯得更為安全，也更具優(yōu)越性。

2.3.3 對小鼠血脂水平的影響

2.3.3.1 對小鼠血清中 TG 及 TC 水平的影響(見圖7)

圖7 PAFL對小鼠TG與TC水平的影響

在小鼠的生長發(fā)育過程中，不同的膳食脂肪構(gòu)成對機體脂質(zhì)代謝有不同的影響。正常量的膽固醇對維持細胞功能、重要激素的合成等起重要作用。但當外源性膽固醇攝入過多時，易在血管壁上沉積，形成斑塊使血管管腔狹窄，心腦組織長期缺氧便可引發(fā)心腦血管疾病；甘油三酯主要存在于乳糜微粒和極低密度脂蛋白中，極低密度脂蛋白及乳糜微粒對血管內(nèi)皮細胞具有細胞毒性作用，能夠促進泡沫細胞的形成和誘發(fā)炎癥反應，使甘油三酯沉積在血管壁中，引發(fā)心腦血管疾病[18]。因此，控制血清膽固醇及甘油三酯含量在正常范圍具有重要的意義。

由圖7可見，高脂模型組相比于正常對照組，小鼠血清TC、TG 水平均有明顯升高。給受試物組小鼠連續(xù)灌胃 28 d 不同劑量的華山松籽油純化亞油酸(PAFL)，小鼠血清 TC、TG 水平明顯低于高脂模型組，且小鼠血清 TC、TG 水平隨灌胃劑量的增加呈下降趨勢。說明給予高脂血癥小鼠灌胃一定量的華山松籽油純化亞油酸(PAFL)會明顯降低其體內(nèi)血脂水平。

2.3.3.2 對小鼠血清中 HDL-C 和 LDL-C 水平的影響(見圖8)

圖8 PAFL對HDL-C與LDL-C水平的影響

低密度脂蛋白(LDL)被稱為是動脈硬化因子，其作用是將肝臟內(nèi)合成的膽固醇運送到肝臟外圍細胞。高密度脂蛋白(HDL)可介導膽固醇的逆轉(zhuǎn)運，將血液中多余的膽固醇從周圍組織轉(zhuǎn)運至肝臟進行再循環(huán)，減少脂質(zhì)在血管壁的沉積。HDL 被認為是動脈粥樣硬化的保護因子。

由圖8可見，與正常對照組相比，高脂模型組小鼠 HDL-C、LDL-C 水平發(fā)生了明顯的變化，受試物組隨華山松籽油純化亞油酸(PAFL)灌胃劑量的增加，HDL-C 呈直線上升趨勢，LDL-C 呈直線下降趨勢。說明一定劑量的華山松籽油純化亞油酸(PAFL)可以升高高脂血癥小鼠血清中的高密度脂蛋白膽固醇水平，降低低密度脂蛋白膽固醇水平，保護血管功能。

2.3.3.3 對動脈硬化指數(shù)的影響(見圖9)

圖9 不同劑量PAFL對AI的影響

由圖9可見，高脂模型組小鼠的動脈硬化指數(shù)(AI) 明顯高于正常對照組，說明高脂模型組小鼠患高脂血癥概率增加。與高脂模型組相比，受試物組小鼠的AI明顯下降，說明華山松籽油純化亞油酸(PAFL)有降低小鼠患高脂血癥的作用，且隨灌胃劑量的增加小鼠的AI下降明顯。說明華山松籽油純化亞油酸(PAFL)可明顯改善小鼠血脂代謝水平，可降低機體動脈粥樣硬化的患病風險。

3 結(jié) 論

本研究以華山松籽油為原料，以純化后亞油酸的純度和得率為指標，通過單因素試驗初步確定尿素包合法分離純化華山松籽油中亞油酸的最佳工藝條件為：混合脂肪酸與尿素質(zhì)量比值0.4，95%乙醇與尿素體積質(zhì)量比值5，包合溫度-10℃，包合時間24 h。在最佳條件下，亞油酸的純度為80.57%。對受試物小鼠連續(xù)灌胃28 d不同劑量的華山松籽油純化亞油酸(PAFL)，研究其對小鼠體重、肝臟重與肝臟指數(shù)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和動脈硬化指數(shù)(AI)的影響。結(jié)果表明，與高脂模型組小鼠相比，華山松籽油純化后亞油酸(PAFL)可以明顯降低高脂小鼠體重、肝臟重及肝臟指數(shù)，降低高脂小鼠血清TC、TG水平，具有提高血清HDL-C水平、降低LDL-C水平及AI的能力。說明華山松籽油純化亞油酸(PAFL)可改善高血脂小鼠的高脂血癥，華山松籽油純化亞油酸(PAFL)可明顯改善小鼠血脂代謝水平，可有效抑制動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展。