免疫熒光抗體法檢測水中賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲

莫婉湫， 賴競峰， 劉曉穎

(東莞市東江檢測有限公司，廣東 東莞 523000)

賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲(簡稱“兩蟲”)是寄生于人和動物體內的致病性原生動物［1］。“兩蟲”的潛伏期長、個體小、致病率高，而且對氯消毒劑具有較強的抗性［2］，影響供水安全［3］。《生活飲用水衛生標準》(GB 5749—2006)規定了飲用水中“兩蟲”的限值為＜1個/10L。

目前“兩蟲”的檢測方法主要有免疫熒光法［4－6］、ICR 法、PCR 法［7－8］等。其中 ICR 法應用最早，但檢測準確性較低［1－2］;PCR法由于需要進行基因檢測，暫未得到廣泛應用;免疫熒光法是目前國內外使用最廣泛、發展最迅速的方法。筆者分別用Envirochek方法和Filta－Max Xpress快速方法過濾濃縮水樣，將離心收集到的賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲進行免疫磁分離和熒光抗體染色，同時通過測試和優化各試驗步驟，探討了檢測過程中的影響因素，以期提高水中“兩蟲”的回收率。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

實驗儀器:IDEXX Pressure Elution型快速淘洗裝置、FM－3800型臺式離心機、Pall帶臂水平振蕩器、DD－5M型離心機、DJ－1型磁力攪拌器，Barnant Masterflex L/S Easy－Load II型蠕動泵、Dynal樣品混合器、VWR渦旋混合器、免疫磁混旋器、Olympus BX 51型熒光顯微鏡、Dynal L10側平面試管、IEDXX快速濾芯、Pall褶聚醚砜濾紙濾囊。

實驗試劑:免疫熒光染色試劑EsayStain、質控標樣ColorSeed、免疫磁分離試劑盒、固封劑、淘洗緩沖液，實驗用水為純水。

1.2 水樣的采集

按照《生活飲用水標準檢驗方法》(GB/T 5750—2006)進行水樣的采集、保存和運輸。

1.3 實驗方法

1.3.1 富集濃縮

① Envirochek方法

在磁力攪拌器上邊攪拌邊過濾水樣，流速為2 L/min，打開排氣閥排氣，待濾囊內注滿水后關閉排氣閥。過濾完畢用純水沖洗采樣容器，一并過濾。每個濾囊中加入110 mL淘洗液后插到帶臂水平振蕩器上，控制排氣口在12點方向，以900 r/min振蕩10 min，將濾囊中的淘洗液全部倒入250 mL錐形離心瓶。再加入110 mL淘洗液到濾囊中，將排氣口設置在4點和8點方向，各振蕩5 min，然后將濾囊中的淘洗液全部倒入250 mL錐形離心瓶中。將離心瓶置于離心機中，1500 g離心15 min，自然減速以避免擾亂沉淀物。

② Filta－Max Xpress快速方法

在磁力攪拌器上邊攪拌邊過濾水樣，流速為4 L/min。過濾完畢用純水沖洗采樣容器，一并過濾。用Pressure Elution型快速淘洗裝置進行淘洗，用500 mL錐形離心瓶收集淘洗液。將離心瓶置于離心機中，2 000 g離心15 min，自然減速以避免擾亂沉淀物。

兩種富集濃縮方法都要在不擾亂沉淀物的情況下吸走上清液，根據壓實沉淀物體積計算出需保留的體積。若沉淀物體積≤0．5mL，保留10 mL液體;當沉淀物體積大于0．5 mL時，則保留體積為沉淀物體積的20倍。

1.3.2 免疫磁分離

定量轉移10 mL水樣濃縮物到側平面試管中，加入1 mL buffer A試劑和1 mL buffer B試劑，再加入賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲磁珠各100μL。將側平面試管置于免疫磁混旋器上，混合1 h。在磁珠捕獲“兩蟲”后，用免疫磁濃縮器的磁極將其與水中其他雜質分離。加入0．1 mol/L鹽酸50μL使磁珠上的“兩蟲”解離，轉移解離液至玻片內。重復操作1次，收集二次酸化的解離液于另一玻片內，每個玻片預先滴加5μL 1 mol/L氫氧化鈉。

1.3.3 熒光抗體染色

4.信息技術和制造技術相互融合。20世紀80年代中后期，日本的信息技術和生產技術已相互融合，大量信息技術開始應用于工業生產過程中，豐田生產模式(多品種、小批量、局部柔性化制造的流水線生產)開始流行。計算機在制造工藝和生產過程中廣泛應用，各種計算機輔助軟件，如計算機輔助制造(CAM)、計算機輔助工藝過程設計(CAPP)、計算機輔助測試(CAT)[8]等進一步提升了制造過程的智能化程度，為開展智能制造打下良好基礎。各類先進生產技術的雛形開始出現并投入生產，如加工中心(MC)機械、自動主體倉庫、機器人、柔性制造系統(FMS)等，進一步實現了制造產品種類的多樣化和生產過程的柔性化。

將玻片于37℃培養箱干燥(干燥時間最長為1 h)，加入50μL甲醛，干燥。

熒光染色:加入50μL Easystain到玻片中，濕盒在37℃下避光培養30 min以上，吸掉液體，加入100μL PBS并靜置2 min，吸除多余的PBS。

DAPI染色:加入50μL DAPI染色液到玻片中，室溫靜置2 min后吸掉過量的液體，加入50μL純水，靜置1 min后吸掉多余的純水。加1滴固封劑后加蓋玻片，避免氣泡。

1.3.4 鏡檢

用熒光顯微鏡對玻片進行全井掃描并計數。賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲都會發出明亮的蘋果綠熒光，其中賈第鞭毛蟲為橢圓形(長8～14μm、寬7～10 μm)，隱孢子蟲為略微橢圓的圓形(直徑為2～6 μm)。在紫外光下，DAPI陽性會出現4個亮藍色的核。

1.4 水樣加標回收試驗

分別用Envirochek方法和Filta－Max Xpress快速方法對純水、出廠水和水源水進行加標回收試驗。每個水樣的體積為20 L，各加入1支質控標樣ColorSeed，鏡檢計數并計算回收率。

1.5 免疫磁分離+染色鏡檢階段的加標回收試驗

將1支質控標樣ColorSeed加入側平面試管內，用10 mL純水代替水樣濃縮物，鏡檢計數并計算免疫磁分離+染色鏡檢階段的回收率、富集濃縮階段的回收率。

2 結果與討論

2.1 水樣加標回收試驗結果

表1 Envirochek方法和Filta－Max Xpress快速方法對“兩蟲”的回收率

從表1可見，兩種方法的加標回收率均達到國標要求(10% ～100%)。此外，無論是純水、出廠水還是水源水，Filta－Max Xpress快速方法的回收率均高于Envirochek方法。兩者對水源水的加標回收率相差最大，這可能是因為富集濃縮的原理不同:Envirochek方法通過褶聚醚砜濾紙濾囊和帶臂水平振蕩器，利用振蕩把“兩蟲”淘洗出來;而Filta－Max Xpress快速方法通過快速濾芯和自動淘洗裝置，后者利用高壓實現對濾芯的反向沖洗，淘洗更充分。

兩種方法的二次酸化操作均可回收到“兩蟲”，因此對磁珠進行二次酸化可提高“兩蟲”的加標回收率。

2.2 二次淘洗對回收率的影響

對水源水加標樣品淘洗后的濾囊和濾芯進行二次淘洗，再進行免疫磁分離、熒光抗體染色、鏡檢。采用Envirochek方法的濾囊二次淘洗后，可使賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲回收率分別提高8%和10%;Filta－Max Xpress快速方法的濾芯采用二次淘洗后，可使賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲回收率分別提高5%和4%。因此，對濾囊或者濾芯進行二次淘洗，均可提高“兩蟲”的加標回收率，其中對Envirochek方法回收率的提高效果更明顯。

2.3 免疫磁分離+染色鏡檢階段的回收試驗

從表2可見，“兩蟲”在富集濃縮階段的回收率低于免疫磁分離+染色鏡檢階段的回收率，說明“兩蟲”在富集濃縮階段最難回收。富集濃縮階段包括濾水、淘洗、濃縮多個步驟，濾水步驟可能會發生“兩蟲”的穿透，淘洗步驟可能存在淘洗不完全的情況，濃縮步驟容易攪動沉淀物，這都會影響“兩蟲”的回收率。因此富集濃縮階段是控制回收率較為關鍵的一步。

表2 不同階段“兩蟲”的加標回收率

2.4 注意事項

2.4.1 過濾階段

控制Envirochek方法的濾速不超過2 L/min，Filta－Max Xpress快速方法的濾速不超過4 L/min。水樣(特別是加標水樣)要在磁力攪拌器上邊攪拌邊過濾;濾器在過濾過程中盡量保持垂直，以有利于“兩蟲”的截留。

2.4.2 淘洗階段

PBST緩沖液現配現用，控制緩沖液pH值在7．4以下，偏堿性時不易洗出“兩蟲”;在緩沖液中加入Tween20，有利于減少原蟲掛壁;對濾囊/濾芯進行二次淘洗可提高“兩蟲”回收率。

2.4.3 濃縮階段

離心瓶與適配器一起用十分之一天平配平，保證誤差在0．5 g以內，盡量減少離心過程的擺動;離心機結束工作后，使樣品自然減速以免擾亂沉淀物，影響濃縮結果;用虹吸法或移液槍吸走上清液時，虹吸管口/槍頭口要在離心杯中心靠近液面處吸取上清液，以減少沉淀的損失。一般保留10 mL液體，如果沉淀物體積大于0．5 mL，要注意計算需保留液體的體積，然后取10 mL濃縮液進行下一步試驗，防止沉淀物過多對“兩蟲”回收率的影響。

2.4.4 捕獲階段

側平面試管在旋搖時不能裝太滿，以留出空間讓磁珠在旋搖過程中與“兩蟲”充分靠近，提高捕獲率。

2.4.5 免疫磁分離階段

用Buffer A試液清洗側平壁試管時，注意只清洗有磁珠的平面，不能將液體晃到其他平面，以防磁珠粘附影響回收。酸化步驟得到的鹽酸洗脫液，最好一次性轉移至載玻片中，以避免多次轉移帶來損耗;轉移鹽酸洗脫液時，不能從磁極上取下磁板，轉移過程中不碰貼壁的磁珠;鹽酸洗脫液移入載玻片后要輕輕吸混鹽酸和氫氧化鈉，使中和完全;過酸或者過堿都會影響“兩蟲”的染色，因此鹽酸和氫氧化鈉的濃度要精確，最好現配現用，以保證在載玻片上的液體最后達到酸堿平衡。

2.4.6 染色階段

載玻片上的樣品干燥可在培養箱中進行，但注意培養箱溫度最好不要超過37℃，干燥時間不超過1 h;Easystain染色如果用到培養箱，需先把濕盒置于培養箱中預熱15 min;Fixing Buffer洗脫液需要保持冰冷，從冰箱取出后2 min之內使用，每次即用即取;Fixing Buffer洗脫液要逐滴緩慢加入，避免溢出中心圓圈。

2.4.7 時間的控制

樣品采集后72 h內完成過濾，過濾后的濾芯/濾囊應置于0～4℃避光保存;淘洗和制片在24 h內完成，從玻片干燥到染色在72 h完成，鏡檢在7 d內完成。

3 結論

由于“兩蟲”會對人體健康產生威脅，為了對其進行有效的防范，必須做好水中的檢測工作。與Envirochek方法相比，Filta－Max Xpress快速方法對“兩蟲”具有更高的加標回收率。對濾囊或者濾芯進行二次淘洗，在過濾、淘洗、濃縮、捕獲、免疫磁分離、染色階段規范方法和步驟，并控制好操作時間，均有助于提高“兩蟲”的回收率。