肺癌特效藥艾維替尼的合成工藝研究

林韋康，高 奇，江曉明*，武立靖

（1.浙江云濤生物技術股份有限公司，浙江 紹興 312369；2.艾依諾科技有限公司，浙江 諸暨 311800；3.南京康瑞醫藥化工有限公司，江蘇 南京 210000）

0 引言

2019 年1 月，國家癌癥中心發布的最新癌癥統計數據顯示，我國癌癥發病率和死亡率均為全球第一，其中肺癌、結直腸癌、肝癌及女性乳腺癌等依然是我國主要的惡性腫瘤，按發病人數順位排序，肺癌位居我國惡性腫瘤發病首位[1-2]。肺癌往往存在表皮生長因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，簡稱EGFR 或ErbB-1 或HER1）的高表達或異常表達，故治療肺癌的常規手段是通過EGFR 酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）來抑制EGFR 的高表達或異常表達。目前，國內市場上的EGFR-TKI 主要分為四代：一代代表藥物為埃克替尼[3]、吉非替尼[4]和厄洛替尼[5]，二代代表藥物為阿法替尼[6]，三代代表藥物為奧希替尼[7]和本文將重點研究的艾維替尼[8]等，四代代表藥物為EAI045[9]，它們的化學結構式如圖1 所示。眾所周知，肺癌腦轉移一直是醫學界的一大難題，而普通的化療藥物較難穿透血腦屏障，通常要借助不良反應率高的放療技術來治療，隨著靶向治療即EGFR-TKI 的出現，肺癌腦轉移患者有了新的治療選擇。采用一代EGFR-TKI 治療肺癌的患者會在半年到一年左右出現耐藥[10-11]；與一代EGFRTKI 相比，二代EGFR-TKI 雖然作用靶點多，但不良反應強，患者耐受性差[12]；三代奧希替尼可以更好地透過血腦屏障，目前臨床上三代奧希替尼是首選藥物，但奧希替尼價格太昂貴，國內每盒售價高達5.1 萬元，很容易導致因病致貧的社會問題；四代EAI045 目前還停留在前期臨床階段。由艾森醫藥自主研發的三代艾維替尼馬來酸鹽若能順利成為首個上市的國產三代EGFR-TKI，憑借價格優勢，市場潛力將空前巨大。

艾維替尼（Avitinib，AC0010），化學名稱為N-（3-{2-[3-氟-4-（4-甲基哌嗪-1-基）-苯基氨基]-7H 吡咯[2，3-D]嘧啶-4-酰氧基}-苯基）-丙烯酰胺，CAS：1557267-42-1，分子式：C26H26FN7O2，分子量：487.53，通常將艾維替尼制成藥學上可接受的鹽如艾維替尼馬來酸鹽、艾維替尼甲磺酸鹽、艾維替尼酒石酸鹽等制劑，供肺癌患者口服治療。文獻報道[13]艾維替尼的馬來酸鹽或鹽酸鹽相比于游離堿艾維替尼本身有三倍的生物利用度。艾維替尼對T790M 陽性患者有良好的耐受性和有效性，雖然穿透血腦屏障的能力較弱，但對無癥狀腦轉移瘤有很好的控制作用[14]，未來艾維替尼的規模化生產將是我國創新藥物大力發展前所未有的機遇。

圖1 肺癌代表性藥物化學結構式Fig.1 The chemical structural formula of representative drugs for lung cancer

目前，國內外關于艾維替尼合成工藝的研究較少，本文在美國ACEA BIOSCIENCES 公司的發明專利US 20150210702[15]基礎上進行改進、優化。該專利以2，4-二氯-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶為起始原料，用2-（三甲基硅烷基）乙氧甲基氯進行硅醚化后先與間硝基苯胺構建醚鍵，再與3-氟-4-甲基哌嗪苯胺發生Buchwald-Hartwig 交叉偶聯反應構造亞胺鍵，最后經硝基還原、丙烯酰氨化、脫硅醚保護、成馬來酸鹽等反應，得到目標化合物，步驟較長，所用溶劑種類多，總收率偏低，特別是應該接近定量轉化的硝基還原收率為85%，丙烯酰氨化收率為75%，脫硅醚保護需分兩步處理，收率也只有65%。另外，幾乎每步反應都要通過柱層析純化，合成路線見圖2。

為開發一套成本低、安全環保可控的艾維替尼合成新工藝，本文仍以價廉易得的2，4-二氯-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶為起始原料，先用乙酰氯保護起始原料吡咯環上的亞胺鍵，然后與間硝基苯酚鈉反應成醚，接著與3-氟-4-甲基哌嗪苯胺進行Buchwald-Hartwig 交叉偶聯成亞胺，再于冰乙酸中用還原鐵粉還原硝基及脫乙酰基保護，最后伯胺上丙烯酰基得到目標產物。此外，也嘗試將所得目標產物制成馬來酸鹽，結果良好。

1 實驗部分

1.1 主要試劑與儀器

使用的主要試劑與儀器分別見表1 和表2。

圖2 專利US 20150210702 中的艾維替尼合成路線圖Fig.2 The ROS of Avitinib in US 20150210702

表1 使用的主要試劑Tab.1 Main reagents

表2 使用的主要儀器Tab.2 Main instruments

1.2 合成方法

1.2.1 合成路線圖

本文改進、優化后的艾維替尼合成路線圖見圖3。

圖3 艾維替尼的合成路線圖Fig.3 The ROS of Avitinib

1.2.2 上保護（產物：1-b）

將二甲苯（300 mL）和2，4-二氯-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶（50.00 g，0.26 mol）投入500 mL 帶有機械攪拌的四口瓶中，開啟攪拌。控溫≤25 ℃滴加乙酰氯（10.38 g，0.13 mol），滴畢，保溫攪拌1 h。保溫攪拌畢，抽濾，濾餅用適量二甲苯洗滌，洗滌液與濾液合并，為1-b 的二甲苯溶液，用適量飽和氯化銨溶液洗滌后去下一步工序。此處的濾餅為2，4-二氯-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶鹽酸鹽，將在2.1 章節敘述其處理方法。

1.2.3 醚化（產物：2-a）

將間硝基苯酚（18.00 g，0.13 mol）與水（100 mL）投入1000 mL 帶有機械攪拌的四口瓶中，用32%氫氧化鈉調pH=7.5，此時反應體系呈淡黃色澄清液體。隨后加入適量相轉移催化劑和1.2.2 中1-b 的二甲苯溶液。控溫25 ℃～30 ℃攪拌12 h 后靜置分層，分去下層水層，上層有機層用飽和食鹽水洗滌后，加入適量活性炭和無水硫酸鈉，攪拌30 min 后抽濾，得到黃色澄清液體，為2-a 的二甲苯溶液，進入下一步工序。

1.2.4 Buchwald-Hartwig 交叉偶聯（產物：3-a）

將上一步工序所得2-a 的二甲苯溶液轉移到500 mL 帶有機械攪拌的四口瓶中，加入0.1 eq乙酸鈀（II）及0.2 eq 配體、碳酸鉀（41 g，0.30 mol），攪拌升溫至80 ℃并保溫5 h。保溫畢，加入適量硅藻土和活性炭，攪拌30 min 后抽濾，濾餅用適量二甲苯洗滌，洗滌液與濾液合并，用飽和食鹽水洗滌并用無水硫酸鈉干燥后，油泵減壓濃縮至瓶壁開始有料析出時停止濃縮，攪拌降溫至10 ℃以下，抽濾，濾餅用適量二甲苯洗滌，得到黃色細小顆粒狀固體濕品，為3-a，于80 ℃下真空干燥得干品56.01 g，以起始原料1-a 計，摩爾收率為85.23%。濾液過硅膠柱還可回收部分3-a，此處不作過多描述。

1.2.5 硝基還原和脫保護（產物：3-b）

將冰乙酸（200 mL）與3-a（10.11 g，0.02 mol）投入帶有機械攪拌的500 mL 四口燒瓶中，攪拌溶清后一次性加入還原鐵粉（4.50 g，0.08 mol），攪拌升溫至80 ℃并保溫3 h，保溫畢，攪拌降溫至30 ℃以下，濾除鐵渣，鐵渣用適量冰乙酸洗滌，洗滌液與濾液合并得到未脫保護的3-b 的冰乙酸溶液，鐵渣去向將在2.4 章節討論。

將得到的未脫保護的3-b 的冰乙酸溶液投入500 mL 帶有機械攪拌的四口瓶中，加入30%鹽酸（50 mL），攪拌升溫至60 ℃并保溫5 h，保溫畢，攪拌降溫至30 ℃以下，先用二甲苯（200 mL）萃取脂溶性雜質，再將萃取后的水層用32%氫氧化鈉調節pH=9，抽濾，濾餅用適量自來水洗滌，于80 ℃下真空干燥，得到淡黃色粉末狀固體干品8.39 g，為3-b，以3-a 計，摩爾收率為97.22%。此處的3-b 濾液去向將在2.4 章節討論。

1.2.6 烯丙基化（產物：Avitinib）

將二甲苯（100 mL）和三乙胺（1.08 g，0.01 mol）、3-b（4.35 g，0.01 mol）投入250 mL 帶有機械攪拌的四口瓶中，攪拌均勻，反應體系呈淡黃色澄清液體。控溫25 ℃以下滴加丙烯酰氯（0.91 g，0.01 mol），滴畢，控溫20 ℃～25 ℃，保溫攪拌1 h，保溫畢，抽濾，濾餅為三乙胺鹽酸鹽，濾液為Avi tinib 的二甲苯溶液，濾液用飽和食鹽水洗滌后加入適量無水硫酸鈉和活性炭，攪拌30 min，抽濾，濾液過快速硅膠柱后減壓濃縮至干，得到淡黃色粉末狀固體4.78 g，為Avitinib，以3-b 計，摩爾收率為97.26%，液相歸一法含量為99.13%。實驗結果說明，丙烯酰氯優先與伯胺反應，3-b 分子上兩個仲胺鍵在反應體系濃度較低的情況下只會很少量地參與競爭反應，副反應產物可用冰乙酸/濃鹽酸的處理方法返回3-b。

1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）：δ11.63（s，1H），10.33（s，1H），9.18（s，1H），7.68（s，1H），7.59（d，J=8.1Hz，2H），7.46～7.39（m，2H），7.10（t，J=4.0Hz，1H），7.02（d，J=8.1Hz，1H），6.82（t，J=8.1Hz，1H），6.47～6.38（m，1H），6.28（d，J=4.0Hz，2H），5.79（d，J=12.1Hz，1H），2.89（t，J=8.1Hz，4H），2.46（t，J=8.1Hz，4H），2.23（s，3H）。

1.2.7 成馬來酸鹽

將馬來酸（2.38 g，0.02 mol）用95%乙醇（10 mL）溶清待用。將95%乙醇（60 mL）和Avitinib（10 g，0.02 mol）投入100 mL 帶有機械攪拌的四口瓶中，攪拌升溫溶清，溶清時反應體系溫度約為60 ℃，控溫55 ℃～60 ℃，于快速攪拌下緩慢將已經配置好的馬來酸95%乙醇溶液滴入反應體系，滴入過程可見反應體系逐漸變渾濁，滴畢，于55 ℃～60 ℃下保溫攪拌1 h，保溫畢，攪拌降溫至10 ℃以下，抽濾，濾餅用適量95%乙醇洗滌，于80 ℃真空干燥，得到淡黃色細小顆粒狀固體11.09 g，為艾維替尼馬來酸鹽，摩爾收率為89.58%。

2 結果與討論

2.1 2，4-二氯-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶上保護

因專利US 20150210702 中用2-（三甲基硅烷基）乙氧甲基氯上保護收率只有53.4%，脫保護也較困難且收率不高，故本文直接淘汰該保護方法。

本文除了上乙酰基保護外，還嘗試起始原料1-a 在丙酮中用碳酸鉀與氯芐反應上芐基保護，收率接近定量轉化，且在乙醇中用Pd/C 加氫脫保護，收率也接近定量轉化，同時加氫過程硝基也被還原成氨基，轉化率很高，但是考慮到加氫工藝被安監總管三[2009]116 號文件定為“高危工藝”，且化工企業氫氣儲存量超過5 t 就是安全意義上的“重大危險源”，故本文出于工業化的考慮，不建議起始原料1-a 上芐基保護。

本文也嘗試1-a 不上保護進行后續反應，發現副反應太多，故不上保護的思路不可取。此處需要強調的是，以起始原料1-a 本身做縛酸劑，反應完畢以其鹽酸鹽形式分離出來，下一批投料時只需液堿中和后，用二甲苯萃取、干燥后即可繼續與乙酰氯反應。

2.2 改用間硝基苯酚鈉替代間硝基苯酚

本文以1-b 與間硝基苯酚在二甲苯溶劑中用堿進行反應，嘗試了碳酸鉀、氫氧化鋰、氫氧化鈉、叔丁醇鈉、三乙胺作為堿，反應效果都不理想。重復專利US 20150210702 中以DMF 為溶劑，碳酸鉀為堿的反應方式，液相監控時發現副反應較多，平均收率只有70%左右。后來出于盡量減少溶劑種類的考慮，嘗試以二甲苯和水在相轉移催化劑的作用下進行兩相反應，實驗效果竟然出乎所料的好。此外，因該步反應仍以二甲苯為溶劑，嘗試將前一步的產物1-b 不分離直接進行反應，發現收率并不受影響。

2.3 Buchwald-Hartwig 交叉偶聯反應改進

專利US 20150210702 中關于該步反應的收率并未報道，本文重復后發現收率雖然超過90%，但需引入新溶劑叔丁醇，用二甲苯替代叔丁醇發現收率不足80%，于是進行催化劑、配體和堿的篩選，最終發現1.2.4 章節中敘述的反應條件最佳，仍用二甲苯為溶劑的突出的好處是2-a 也不必分離出來。

2.4 硝基還原方法的選擇

本文嘗試用專利US 20150210702 中乙醇、還原鐵粉、氯化銨的反應條件，發現硝基還原效果較好，但仍需將氨基物分離出來尋找新的方法脫乙酰基保護，步驟較為繁瑣。于是采用冰乙酸、還原鐵粉的方法先進行硝基還原，產生的副產物鐵渣嘗試用于污水站芬頓氧化工段與硫酸亞鐵混合使用，小試發現降低廢水COD 效果較好。濾除鐵渣后的氨基物冰乙酸溶液只需加入適量的濃鹽酸即可脫乙酰基保護且效果較好，值得一提的是乙酰基脫保護后也是冰乙酸，故3-b 的濾液考慮制備乙酸鈉是可行的。

2.5 艾維替尼成馬來酸鹽過程

用無水乙醇和95%乙醇分別做溶劑進行Avitinib 與馬來酸的成鹽試驗，發現均可得到淡黃色細小顆粒狀固體，區別是無水乙醇制得的艾維替尼馬來酸鹽熔點為201.5 ℃～203.9 ℃，95%乙醇制得的艾維替尼馬來酸鹽熔點為180.5 ℃～182.7 ℃，另外用智能自動水分滴定儀發現95%乙醇制得的艾維替尼馬來酸鹽含有5.8%～7.6%的水分，推測95%乙醇制得的艾維替尼馬來酸鹽分子結構上可能帶有兩個結晶水，與文獻[16]吻合。

3 結論

本文所述的艾維替尼合成工藝較文獻更為簡便，上保護、醚化兩個工序所得產物不需分離就可以直接進入下一步偶聯工序。除硝基還原、成馬來酸鹽工序外，其余反應都采用價廉易得、回收率高的二甲苯為溶劑，溶劑單一在工業上占有優勢。此外，乙酰氯替代2-（三甲基硅烷基）乙氧甲基氯使生產成本大幅減少，操作上彈性空間也更大。值得一提的是，本文將硝基鐵粉還原的副產物鐵渣用于廢水處理不失為一個大膽的嘗試，既解決了廢渣難處理的問題，也節省了廢水處理用藥劑。因此，本文所述的艾維替尼合成工藝安全環保可控、可操作性強、原料成本降低，可為艾維替尼生產廠家提供一定的參考。