12-脂肪氧合酶通路在腫瘤發生發展中的作用

夏軼男 于丹 金春順 王樹越

(吉林大學 1第二醫院耳鼻咽喉頭頸外科，吉林 長春 130041； 2中日聯誼醫院新民門診)

腫瘤是機體細胞異常增殖形成新生物的過程，它的形成是在各種致瘤因素作用下，細胞生長與增殖的調控發生嚴重紊亂〔1〕。其病理特征是高增殖、低分化和凋亡減弱，后期出現細胞的黏附和運動改變，導致轉移的發生。細胞在生長過程中會受到多種調節因子的影響，特別是生長因子、生長因子受體、信號傳導蛋白和轉錄因子等，而這些因子的變化也可能導致腫瘤的發生〔2〕。目前研究已證實12-脂肪氧合酶(LOX)通過促進腫瘤細胞活力和血管新生、影響細胞周期進程等方式促進癌癥的發生和轉移，如前列腺癌、結腸直腸癌、乳腺癌和卵巢癌等〔3〕。但是關于12-LOX及其體內的代謝產物12-羥基二十碳六烯酸(HETE)與癌癥發生發展的確切機制仍不明確。現對12-LOX/12-HETE調控的信號通路在腫瘤發生發展中的作用機制進行綜述。

1 12-LOX概述

1.112-LOX的分子結構及命名 LOX屬于氧化還原酶，是一類含非血紅素鐵的蛋白質，能專一催化具有1-，4-順-戊二烯結構的多元不飽和脂肪酸發生氧化。氧化的脂質隨后發生生物反應，通過特定細胞表面受體激活細胞信號傳導通路或者進一步代謝成有效的脂質介質而發揮生物學作用。研究顯示LOX廣泛存在于動物、植物、細菌及真菌中。在植物中，LOXs根據氧分子插入到亞麻酸或α-亞麻酸中的位置不同，分為9-，13-LOX，代謝產物為9-HETE，13-HETE。而在哺乳動物中，LOX的底物主要是花生四烯酸，根據氧分子在AA上的位點不同，將LOXs分為5-，12-，15-LOX，代謝產物分別為5-HETE，8-HETE，12-HETE，15-HETE〔4〕。這些代謝產物在不同程度上參與了人體的病理及生理過程，影響細胞增殖及凋亡或促進/抑制血管新生等。雖然LOXs的結構相似，但由于底物不同，每一個亞型的作用都不盡相同。

1.212-LOX的分型 12-LOX有血小板型、白細胞型和上皮型三種亞型。其中白細胞型主要存在于大鼠、小鼠、豬和牛，在哺乳動物中沒有發現。血小板型12-LOX是目前研究的比較多的，12(S)-LOX的基因編碼為ALOX12(人類)/Alox12(小鼠)，主要存在于血小板、角質細胞和某些腫瘤細胞中〔5〕。它高度的區域和立體特性，主要產生的12-HpETE，隨后逐漸減少形成12(S)-HETE。12(S)-LOX的同源異構體12(R)-LOX的基因編碼為ALOX12B(人類)/Alox12b(小鼠)，最初是在牛皮癬上發現的，現在研究發現主要表達在皮膚和上皮組織中〔5,6〕。由于人類的15-LOX-1和12-LOX具有很大的同源性，所以在一些文獻中把它們歸類為12/15-LOX，產生的代謝產物為12-HETE和15-HETE〔4〕。12-LOX基因的多形性與許多疾病的發生發展有關，包括腫瘤。大量文獻證明12-LOX 參與了前列腺癌、乳腺癌、結腸癌等多種腫瘤的形成和發展過程〔7～9〕。LOX 在腫瘤的形成、增殖和轉移中起關鍵作用。

2 12-LOX在各種腫瘤的作用

2.112-LOX在結腸癌中的作用 最初研究者認為只有細胞色素P450參與結腸癌的發病中，后來發現12(R)-LOX/12(R)-HETE參與人類的皮膚癌癥中，于是考慮到12(R)-LOX/12(R)-HETE是否在腫瘤中也發揮作用，但是關于12(R)-HETE和腫瘤關系的研究比較少，反而提示12(S)-HETE和腫瘤之間存在某種聯系。12-LOX與結腸癌患病風險有關，比如E261R基因突變，該基因突變能夠引起12-LOX的活性增加，與食管鱗狀細胞癌、結直腸癌發病有關〔6,10〕。體內和體外研究結果顯示12-LOX在肝癌細胞的增殖和抗凋亡中發揮著重要的作用，并指明ALOX12的致癌功能需要內源性產生脂質調節劑，這些結果都說明12-LOX調控的通路與癌癥的發病風險相關〔11〕。Klampfl等〔9〕用SW480、SW620和Caco20三種結腸癌細胞研究12(S)-HETE的作用，通過MTT和transwell實驗發現3種細胞的細胞活力雖然表現不同，但是均具有較強的遷移能力，尤其是SW480細胞在12-LOX作用下生長和遷移能力明顯高于其他兩種細胞系，這一點通過12-LOX的應用抑制劑黃芩黃素和敲除12(S)-LOX再次得到了驗證。眾所周知，NADPH氧化酶復合物的催化亞基Nox1主要表達于腸上皮細胞和血管平滑肌細胞中，在天然免疫防御和細胞增殖中發揮作用。而在結腸腺癌細胞擴增過程中Nox1之所以被激活是依賴O2產生，Carvalho等〔12〕實驗證明12(S)-LOX的抑制劑能夠有效地抑制O2的生成，即12(S)-LOX通路作為Nox1活化的上游，控制細胞的擴散和增殖。12-LOX除了能對上皮細胞產生影響，還可以誘導結腸癌成纖維細胞的收縮，增強結腸癌的侵襲性，Stadler等〔13〕實驗說明了12(S)-HETE通過MLC2，RHO/ROCK和Ca2+信號對成纖維細胞發揮作用，而臨床藥物卡馬西平、桂利嗪、硝苯地平和鹽酸倍普地爾等就是干擾細胞Ca2+的有效性，抑制成纖維細胞的收縮。這些結果表明12(S)-LOX在結腸直腸癌炎癥區域的表達具有誘導結腸直腸癌細胞侵襲表型的能力，且這種能力可能與細胞系具有相關性。在后續的研究中，該作者發現細胞表面的E-鈣黏蛋白(E-Cadherin)和整合素β1以12(S)-LOX依賴的方式下調從而細胞間的相互作用受到了破壞。Chang等〔14〕在動物實驗研究中發現：在結腸癌MC38細胞中應用12(S)-HETE抑制劑PD146176后，腫瘤的生長受到了抑制。

2.212-LOX在前列腺癌中的作用 關于12-LOX/12-HETE與整合素表面表達在前列腺癌中的作用報道比較多，整合素是一種黏附受體家族，介導細胞與結構和基質固定化蛋白的結合，以促進細胞存活、增殖和遷移。過表達的12-LOX可以上調αvβ3和αvβ5整合蛋白的表達最終導致前列腺癌細胞系PC-3的生存能力提高〔15〕。而Dilly等〔16〕研究發現12-LOX和基質金屬蛋白酶(MMP)9在前列腺癌血管生成方面也存在關聯。在前列腺癌PC-3細胞中，過表達12-LOX可以使MMP9在mRNA和蛋白水平升高，且能夠增加MMP9的分泌，這種作用在野生型的PC-3細胞中同樣有效。其次，應用藥物和基因抑制方法，發現12-LOX能夠激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(PKB)通路，促使核因子(NF)-κB驅動MMP9的表達，隨后提升內皮細胞的趨化能力。而且在使用相應的抑制劑后發現內皮細胞的遷移能力受到了抑制。12-HETE參與了血管新生，尤其是在前列腺癌細胞中通過轉染方法轉入血小板型12-LOX片段，血管內皮生長因子的分泌明顯增多，而且這種升高可被LOX的抑制劑如去二甲氫愈創木酸4，4'-(2,3-二甲基四亞甲基)二鄰苯二酚(NDGA)、黃芩黃素所抑制。McCabe等〔17〕講述了12-HETE可能通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑發揮對血管內皮生長因子的調控作用。12-LOX對血管內皮生長因子的調控機制，作者認為12-LOX使缺氧誘導因子-1α在mRNA水平和蛋白水平上高表達或者使其活性增強，進而使前列腺癌細胞在缺氧條件下血管內皮生長因子分泌增多或活性增強，但無論哪種機制都說明12-HETE參與癌癥的血管新生〔18〕。

一篇關于評價12-LOX和血纖維蛋白溶酶原活性抑制因子(PAI)-1作為前列腺癌預后指標的研究，作者用良性前列腺增生患者為對照組，癌癥為實驗組，分別檢測兩組病人血漿和富含血小板的血漿中12-HETE的濃度，驗證12-HETE是否能成為前列腺癌預后的一個觀察指標。在實驗的過程中，作者發現癌癥患者中富含血小板的血漿中12-HETE的濃度低于良性前列腺增生的患者〔7〕，這個結果與之前的研究不同〔19〕，但是與Gohara等〔20〕的結果相似，Gohara等〔20〕研究顯示12-LOX在正常腎臟組織中的表達明顯高于低分化的腎癌患者，并且在惡性程度加重時，12-LOX的表達也不能達到在正常組織中的水平。但無論12-LOX在前列腺癌中的作用到底是什么，對其機制的研究仍需繼續。

2.312-LOX在胰腺癌中的作用 關于12-LOX與胰腺癌的關系研究文章在Pubmed上查詢到的較少，而且多數是早期發表的，其中最早的是Ding等〔21〕的研究，該作者在PANC-1,MiaPaca2,Capan2和ASPC-1四種胰腺癌細胞系中發現12-LOX的表達均高于正常組織，且12-LOX抑制劑以濃度和劑量依賴的方式抑制胰腺癌細胞的增殖。隨后作者對12-HETE在胰腺癌的發病機制進行了研究，發現12-LOX的抑制劑黃芩苷在細胞內碳酸酐酶活性升高的同時，促使細胞形態發生顯著變化，因此提示12-LOX抑制劑可誘導人胰腺癌細胞分化表型增多，從而發揮促癌作用〔22,23〕。而且該作者在3年內相繼發表了數篇關于12-HETE在胰腺癌中作用的文章，并對其機制進行深入探討，得出12-HETE通過刺激細胞間蛋白發生酪氨酸磷酸化，激活細胞外調節蛋白激酶(ERK)途徑促進胰腺癌發展〔24〕。MAPK一直以來與多種細胞功能有關，包括絲裂原對細胞周期進程的影響，調節胚胎發育和神經元分化等。據報道在哺乳動物體內至少有3種不同的MAPK信號傳導細胞，如ERK、c-jun氨基末端激酶(JNK)/應激激活蛋白激酶(SAPK)、P38MAPK。用12-HETE處理胰腺癌細胞后，可以發現ERK在10～30 min內即可發生磷酸化，而且能夠持續24 h，在應用MEK抑制劑PD098059和U0126后，胰腺癌細胞的增殖受到了抑制，然而根據數據顯示，ERK和細胞蛋白酪氨酸激酶激活均參與了12(S)-HETE誘導的胰腺癌細胞增殖，但P38和JNK/SAPK不參與這一有絲分裂過程。當然，也不排除實驗結果受細胞類型的影響，也或許細胞間的信號傳遞有其他的因子參與〔24〕。在這些研究的基礎上，Tong等〔25〕用含有黃芩黃素的培養液培養胰腺癌細胞，檢測發現抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1表達明顯降低，促凋亡蛋白Bax表達升高，顯著誘導細胞色素C從線粒體釋放到細胞質中。Caspase-9、caspase-7和caspase-3經處理后均被激活。在動物實驗中給小鼠胸腺內異種移植模后，也證實了黃芩黃素對胰腺癌的生長抑制作用和誘導細胞凋亡。LOX抑制劑在體內和體外均可通過線粒體途徑阻斷胰腺癌細胞增殖并誘導細胞凋亡。由此可見，12-LOX促進胰腺癌細胞發展的結論基本確定，但是關于機制的研究報道卻非常少。

2.412-LOX在卵巢癌中的作用 卵巢上皮癌是婦產科第二大常見癌癥，是導致女性因癌癥死亡的第五大原因。Guo等〔26〕通過Western印跡等方法證明了12-LOX對卵巢上皮癌具有促進發展的作用，并通過12-LOX的抑制劑——BMD-122、黃芩黃素和siRNA進行了證明，同時作者對其發生的機制也進行了研究，結果顯示12-LOX調節兩種卵巢癌細胞系OVCAR-3和SK-OV-3的生長是通過MAPK途徑，而不是PI3K，也不是PKB和ERK。而且在檢測BMD-122對癌細胞的作用時發現，BMD-122激活caspase-3和caspase-9后促進細胞發生凋亡。最近Liu等〔27〕發表了一篇關于12-HETE促進卵巢癌發展相關機制的文章，首先作者發現了12-LOX以劑量依賴的方式抑制卵巢癌細胞凋亡，并且這種作用受到了整合素相關激酶(ILK)通路的調控，并找到相關下游靶點為NF-κB，當阻斷NF-κB通路后，12-HETE對細胞凋亡的抑制作用減弱，這些結果都說明了12-LOX對上皮卵巢癌的作用是正向的。

2.512-LOX在乳腺癌中的作用 乳腺癌是女性發病率最高的腫瘤，在世界范圍內其發病率逐年升高，乳腺癌的發病因素尚不清楚，但是目前認為發病與激素，尤其是雌酮及雌二醇具有直接關系，而且在乳腺癌轉移的過程中許多信號因子也發揮了重要作用〔28〕。最初研究的焦點主要集中在環氧酶-2和5-LOX與乳腺癌之間的關系，研究結果已經證實其對乳腺癌具有正性調節作用。在后來的研究中Tong等〔29〕發現12-LOX所具有的有絲分裂作用，能夠促進人乳腺癌細胞MCF-7(雌激素陽性)和MDA-MB-231(雌激素陰性)兩種細胞系的增殖，且12-LOX的抑制劑黃芩黃素能夠誘導細胞色素C釋放、caspase-9活化及下游caspase-3、caspase-7活化和PARP裂解，同時還降低了抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1的表達水平，增加了促凋亡蛋白Bax的表達。而且Carcia等〔30〕在研究中發現多元不飽和脂肪酸與褪黑素可以增加機體的免疫應答和腫瘤細胞的凋亡，兩者協同可以減少12-HETE的產生，使乳腺癌細胞凋亡增加。乳腺周圍有豐富的淋巴循環，這為乳腺癌發生淋巴轉移提供了有利條件。近幾年內，部分研究者利用現代科技手段，觀察腫瘤細胞的運動情況〔31,32〕，他們將乳腺癌細胞球狀體與單層淋巴內皮細胞(LEC)結合進行共培養。Nguyen等〔31〕和Vonach等〔32〕的研究結果從不同的角度證明了12(S)-HETE能夠誘導乳腺癌細胞發生轉移，主要的機制是腫瘤球狀體分泌的12(S)-HETE能夠使腫瘤外面的單層LEC發生收縮，使細胞間的鏈接出現空隙而引起腫瘤細胞發生遷移。在這個過程中Vonach等〔32〕認為12(S)-HETE誘導單層的淋巴內皮細胞產生循環化學反應誘導缺陷而發生作用，Nguyen等〔31〕認為AHR及其靶點細胞色素P450 1A1 相互作用誘導體外腫瘤細胞穿越LEC屏障通道發生遷移，其分子機制可能是在研究中作者發現芳香烴受體(AHR)能夠誘導CYP1A1表達和12(S)-HETE在乳腺癌腫瘤球狀體內分泌，導致細胞與細胞連接處出現較大的空隙，為腫瘤細胞遷移提供條件。這些結果都從不同的途徑證明了12-HETE對乳腺癌的發生發展具有促進作用。而當前很多研究者除了繼續探討12-LOX在乳腺癌中的機制外，也將12-HETE與乳腺癌術后效果聯系起來。Singh等〔8〕通過對86例乳腺癌患者的血液及組織樣本進行研究，采用表面等離子體共振及酶聯免疫吸附試驗(ELISA)技術對研究組中的血清12-LOX進行定量分析，發現75%以上患者化療后血清中12-LOX的濃度顯著降低，這也是作者首次量化12-LOX和乳腺癌患者的臨床病理參數之間的關系，將乳腺癌術后患者血清中的12-LOX作為判斷預后的標記物。該作者在此后的幾年中采用固相多肽合成法設計了十多種肽，用來判斷對乳腺癌的作用，發現其中一種肽類——YWCS，能夠通過抑制12-LOX的生物學作用或者降低人體對12-LOX的利用度，從而降低乳腺癌MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞的生存能力，促發凋亡反應，同時體內實驗也驗證了多肽對小鼠異種移植的腫瘤生長有顯著抑制作用，目前這種肽可以作為一種先導化合物和補體，用于正在進行的乳腺癌分化治療研究〔33〕。

3 小 結

許多學者先后證實12-LOX對腫瘤的影響并發現其調控機制，例如12-LOX可以通過MAPK、NF-κB等通路對癌癥進行調控。也正是由于對它的研究也日益廣闊，12-LOX在人體中的作用也越來越被重視，如今通過對癌癥術后患者體內12-LOX/12-HETE的含量來判斷患者治療的效果。然而由于人體內環境的不斷變化，細胞間的交流也瞬息萬變，12-LOX及其通路在調控癌癥發展的過程中是否有其他通路參與進來、12-LOX/12-HETE對同一腫瘤不同細胞系的作用是否存在差異及體外實驗的局限性等原因也困擾著許多科學家。但無論怎樣，隨著科學技術的不斷發展，相信更多的學者能為12-LOX在人體中的作用及機制提供新思路。