外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目與老年晚期非小細(xì)胞肺癌患者療效及預(yù)后的相關(guān)性

茍小麗 苑成 柏玉舉 石磊 邢時云 馬虎

(遵義醫(yī)科大學(xué) 1第一附屬醫(yī)院腫瘤科，貴州 遵義 563000；2第三附屬醫(yī)院)

肺癌是一種威脅人類健康及生命安全的主要惡性腫瘤疾病，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是其常見類型，在全部肺癌患者中占比為75%～80%，現(xiàn)有的根治術(shù)、化療、放射治療、靶向治療、生物治療等手段應(yīng)用效果均不盡人意，患者5年生存率仍低于20%，腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)是其治療失敗主要原因〔1，2〕。多數(shù)在確診時已經(jīng)發(fā)展至晚期，只具備姑息放化療指征，對這類患者的化療周期制定是臨床醫(yī)生多面臨難題，對已經(jīng)接受多種綜合治療的患者是否還需要維持治療也是臨床醫(yī)師所要關(guān)注的問題。可見早期評估患者治療情況及預(yù)后，對指導(dǎo)患者未來治療方案的制定意義重大。血行播散是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移重要途徑，腫瘤細(xì)胞入侵血管需要多個步驟，外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)是存在于轉(zhuǎn)移瘤及原發(fā)瘤的進入血流的腫瘤細(xì)胞，該腫瘤細(xì)胞主要因診療操作或自發(fā)等原因，通過轉(zhuǎn)移灶或?qū)嶓w瘤釋放進入外周循環(huán)，從而形成一類細(xì)胞〔3，4〕。這類腫瘤細(xì)胞多數(shù)在進入外周血后，均會在短時間內(nèi)被機體免疫系統(tǒng)所識別并排除，只有極少部分存活并隨血液運行，在合適的時間黏附在血管壁上，侵襲血管壁并進入到組織間質(zhì)及實質(zhì)，進行分裂增殖，最終形成轉(zhuǎn)移灶〔5，6〕。由上述論述可以推測外周血CTCs數(shù)目可作為晚期NSCLC患者療效及預(yù)后預(yù)測評估指標(biāo)，但目前國內(nèi)臨床與之相關(guān)的研究報道并不多見。本研究旨在分析老年晚期NSCLC患者CTCs數(shù)目與患者療效及預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1納入對象 在征得遵義醫(yī)科大學(xué)第一、第三附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)同意后，選擇2016年3月至2018年3月收治的50例晚期NSCLC老年患者作為研究對象，男28例，女22例；年齡60～90〔平均(75.12±8.51)〕歲；腫瘤分期：6例ⅢA期，17例ⅢB期，27例Ⅳ期；病理類型：32例腺癌，17例鱗癌，1例大細(xì)胞癌；分化情況：5例高分化癌，18例中分化癌，27例低分化癌。全部患者及其家屬對本次研究實施的內(nèi)容知情并簽署知情同意書。

1.2入選標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥60歲；②經(jīng)組織病理學(xué)確診為NSCLC，并符合《中國晚期原發(fā)性肺癌診治專家共識(2016年版)》〔7〕中晚期NSCLC診斷標(biāo)準(zhǔn)；②符合2009年肺腫瘤TNM分期中ⅢA期、ⅢB期、Ⅳ期診斷標(biāo)準(zhǔn)〔8〕；③全部患者在入組前未接受其他局部抗腫瘤治療或全身治療；④患者預(yù)計生存時間>3個月；⑤患者入院時心、肝、腎功能檢查均正常，血常規(guī)檢查結(jié)果正常，對化療均可耐受；⑥在院接受至少2個周期的化療。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①早期NSCLC患者或入院時已經(jīng)接受過放射治療或化療的患者；②既往有其他惡性腫瘤疾病治療史者；③合并其他惡性腫瘤疾病者；④無可測量病灶者；⑤治療依從性差，隨訪可能小；⑥合并嚴(yán)重心肝腎等其他重要臟器衰竭者或造血系統(tǒng)疾病者；⑦其他對化療治療無法耐受者；⑧合并心理疾病或精神障礙等無法很好配合治療與隨訪者；⑨治療前遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者。

1.3研究方法

1.3.1治療方法 全部患者接受多西他賽+順鉑的化療方案，化療第1天給予患者多西他賽(正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20183209)75 mg/m2靜滴，靜滴時間為1 h；化療第1～3天給予患者順鉑(貴州漢方制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20020272)25 mg/m2靜滴。以3 w作為1個治療周期，在持續(xù)化療6個周期后評估療效，并隨訪1年，評價并記錄患者預(yù)后情況(復(fù)發(fā)情況)。

1.3.2療效評估標(biāo)準(zhǔn) 全部患者在入院時接受肺部計算機斷層掃描(CT)掃描、頭部磁共振成像(MRI)、腹部彩超及全身骨掃描，明確疾病分期并評估預(yù)后。參照《實體瘤治療療效評價標(biāo)準(zhǔn)-RECIST》中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)評估療效〔9〕：①完全緩解：全部目標(biāo)病灶完全消失，病理淋巴結(jié)縮小，各淋巴結(jié)短徑均低于1 cm，且持續(xù)至少4 w；②部分緩解：目標(biāo)病灶較化療實施前明顯縮小，直徑綜合較基線減少至少30%，且持續(xù)至少4 w；③進展：以全部可測量病灶直徑之和最小值作為參照，治療結(jié)束時直徑之和相對增加超過20%或直徑之和絕對值增加超過5 mm，或有新病灶出現(xiàn)；④穩(wěn)定：靶病灶變化情況未達(dá)到部分緩解，增加的水平也未達(dá)到進展，在部分緩解與進展之間。完全緩解+部分緩解=有效。

1.3.3預(yù)后評估 隨訪1年后，檢測并觀察患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及死亡情況，將隨訪發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或死亡者視為預(yù)后不良。

1.3.4外周血CTCs數(shù)目檢測方法 ①儀器與設(shè)備：美國楊森公司提供的血樣本儲存管、分析儀、孵育裝置、循環(huán)上皮細(xì)胞檢測試劑盒、循環(huán)細(xì)胞質(zhì)控品試劑盒、緩沖液；德國吊籃式離心機，美國Thermo公司提供試管架、移液管與槍頭、渦旋混勻器、去離子水。②試驗步驟：分別在化療前、每化療2個周期后取患者肘正中靜脈采集全血7.5 ml，混勻樣本保存，在96 h內(nèi)進行CTCs的采集與分析。將全血樣本離心處理后取上清液，分別向內(nèi)加入緩沖液及磁顆粒并孵育，處理后吸出磁顆粒移除磁場，加入染色劑標(biāo)記便于區(qū)分，使用細(xì)胞分析處理系統(tǒng)處理樣本并轉(zhuǎn)移至樣本盒內(nèi)，后進行掃描分析，經(jīng)免疫富集、熒光標(biāo)記等方法進行細(xì)胞計數(shù)。③CTC篩選及分離：白細(xì)胞染色為CD45，即白細(xì)胞特有抗體；上皮細(xì)胞染色為CK，即上皮細(xì)胞特有抗體，細(xì)胞核染色及DAPI。結(jié)合特征識別CTC，系統(tǒng)自動標(biāo)記并初步篩查，最終經(jīng)資深病理科醫(yī)生進行審核與認(rèn)定。

1.3.5CTCs判定標(biāo)準(zhǔn) ①較正常細(xì)胞擁有更大的細(xì)胞體積；②細(xì)胞核增大；③細(xì)胞核大小變異大，具有多形性特點；④染色質(zhì)染色有三維層次；⑤核質(zhì)比增高基本接近1∶1；⑥熒光染色標(biāo)記為EpCAM+CK+DAPI+CD45+。陽性結(jié)果判定：非小細(xì)胞肺癌CTCs陽性判定最佳臨界值為1個，即7.5 ml外周血中只要發(fā)現(xiàn)CTCs均可判定為陽性。

1.4觀察指標(biāo) 治療結(jié)束時觀察化療效果，對比不同治療效果的患者CTCs數(shù)目；將隨訪1年后遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與死亡者作為預(yù)后不良組，其他作為預(yù)后良好組，對比兩組患者CTCs數(shù)目；經(jīng)Spearman相關(guān)性分析檢驗外周血CTCs數(shù)目與老年晚期NSCLC患者療效及預(yù)后的相關(guān)性。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1療效 全部50例老年晚期NSCLC患者均接受化療治療，在化療6個周期后，完全緩解、部分緩解、進展、穩(wěn)定例數(shù)分別為1例(2.00%)、15例(30.00%)、9例(18.00%)、25例(50.00%)，有效率為32.00%(16/50)。

2.2隨訪結(jié)果 50例患者化療期間均無死亡病例，化療結(jié)束隨訪1年，50例患者中12例發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率為24.00%，10例死亡，死亡率為20.00%，預(yù)后不良22例，占比44.00%；其他28例患者均為預(yù)后良好組。

2.3不同治療效果CTCs陽性檢出結(jié)果 化療實施前50例患者基線評估CTCs陽性率為40.00%(20/50)，化療6個周期后，其CTCs陽性率為26.00%(13/50，安全緩解0例，部分緩解2例，進展8例，穩(wěn)定3例)，較化療前顯著降低，且化療后CTCs陽性率多見于病情進展或穩(wěn)定患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=20.900,P<0.001)。

2.4不同預(yù)后CTCs陽性檢出結(jié)果 隨訪1年后，預(yù)后不良組患者CTCs陽性率〔40.91%(9/22)〕顯著高于預(yù)后良好組〔14.29%(4/28)〕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.539,P=0.33)。

2.5老年晚期NSCLC患者外周血CTCs陽性率與療效、預(yù)后相關(guān)性分析 外周血CTCs陽性率與老年晚期NSCLC患者療效呈負(fù)相關(guān)(r=-0.487，P<0.001)，即隨著患者CTCs陽性率越高，患者療效越差。外周血CTCs陽性情況與老年晚期NSCLC患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)(r=-0.301，P=0.333)，即隨著CTCs陽性率越高，患者預(yù)后越差。

3 討 論

在全部惡性腫瘤疾病中，肺癌的患病率及死亡率均居榜首，現(xiàn)已成為主要的惡性腫瘤疾病之一，每年新增病例數(shù)及死亡人數(shù)在全部惡性腫瘤疾病中占比分別為12.7%、18.2%〔10〕。NSCLC是肺癌常見的類型，其早期無典型癥狀，侵襲能力強，多數(shù)患者在確診時病情已發(fā)展為中晚期，甚至部分患者已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，錯失最佳的手術(shù)機會，這就決定了化療在晚期NSCLC治療中的重要地位〔11〕。通常，NSCLC患者對化療藥物敏感度多為中度，化療的有效率在30%～50%，無病進展期一般為6～9個月〔12〕。

因腫瘤細(xì)胞主要經(jīng)淋巴道及血道轉(zhuǎn)移，故腫瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)多與循環(huán)內(nèi)腫瘤細(xì)胞有關(guān)，故推測化療結(jié)束后監(jiān)測患者外周血中殘余腫瘤細(xì)胞可評估其預(yù)后。目前，化療已經(jīng)成為晚期NSCLC患者基本且重要的治療手段之一，以鉑類為基礎(chǔ)的二聯(lián)化療方案已成為晚期NSCLC患者標(biāo)準(zhǔn)治療方案，患者化療近期效果理想，且毒副反應(yīng)較其他方案更輕微，患者對化療方案的耐受性有所提高〔13〕。轉(zhuǎn)移是腫瘤化療失敗主要原因，是一個多步驟、多階段且復(fù)雜的病理過程，由原發(fā)瘤或轉(zhuǎn)移瘤脫落腫瘤細(xì)胞進入淋巴系統(tǒng)或血流中，后形成CTCs，為惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移發(fā)展及增殖創(chuàng)造了條件〔14〕。因CTCs來源于腫瘤組織，故其數(shù)量在一定程度上可以直接反映晚期NSCLC患者體內(nèi)腫瘤的負(fù)荷情況〔15〕。Xu等〔16〕在2015年使用相關(guān)系統(tǒng)對66例NSCLC患者外周血CTCs進行檢測，結(jié)果顯示，陽性率為71.21%，提示外周血CTCs陽性情況可能與患者惡性程度有關(guān)。故推測可將外周血CTCs用于老年晚期NSCLC患者化療效果及預(yù)后的評估。RECST實體瘤療效評估依然是晚期NSCLC患者化療效果主要評價標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)患者局部病灶、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶及區(qū)域淋巴結(jié)變化情況判定效果〔17〕。本研究結(jié)果顯示，外周血CTCs的動態(tài)監(jiān)測較其他手段用于老年晚期NSCLC患者化療療效評估敏感度較高，利于指導(dǎo)患者化療早期方案的更改，對避免患者承受不必要的過渡治療或無效治療意義重大。此外，本研究還觀察了老年晚期NSCLC患者外周血CTCs陽性率與預(yù)后的相關(guān)性。腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及患者生存情況均是預(yù)后判斷重要因子，機體內(nèi)淋巴通道及循環(huán)系統(tǒng)均是腫瘤細(xì)胞達(dá)到遠(yuǎn)處器官重要途徑，腫瘤細(xì)胞需要經(jīng)過淋巴循環(huán)或血液循環(huán)才可到達(dá)各臟器中定植增殖，從而形成新的病灶，故檢測惡性腫瘤疾病患者的循環(huán)細(xì)胞數(shù)目是評估是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵〔18〕。本研結(jié)果顯示外周血CTCs數(shù)目的監(jiān)測可以考慮作為老年晚期NSCLC患者預(yù)后的評價指標(biāo)。因本研究樣本量不足，加之受研究時間及研究條件的限制，獲得的結(jié)果可能存在偏移，得到的結(jié)論也可能有其不足，故還應(yīng)在未來開展大樣本、多中心、前瞻性、長時間的研究加以證實。

綜上所述，外周血CTCs在老年晚期NSCLC中的表達(dá)情況與患者化療效果、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及死亡風(fēng)險密切相關(guān)，可將外周血CTCs陽性數(shù)目與腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合使用，以為未來老年晚期NSCLC患者的療效及預(yù)后評估提供依據(jù)。