腫瘤微環境剛性的病機探討?

高卓維，韓欽芮，符秀瓊，姚學清，陳騰祥，孫學剛,△

(1.南方醫科大學順德醫院，廣東 佛山 528300；2.南方醫科大學中醫藥學院，廣州 510515；3.廣東省人民醫院胃腸外科，廣州 510080；4.貴陽醫科大學科技處，貴陽 550025)

機體某個部位的硬塊，臨床醫生會高度懷疑其是否為腫瘤，這提示相比于原有的正常組織，實體腫瘤的硬度增加。腫瘤微環境的重構是“積聚”硬度逐漸增強的主要機制。我們此前提出，在正氣虧虛基礎上，痰凝、血瘀參與腫瘤微環境的重構，導致癌毒結聚[1-2]。《靈樞·百病始生》：“腸胃之絡傷，則血溢于腸外，腸外有寒，汁沫與血相搏，則并合凝聚不得散，而積成矣”，提示痰瘀可能參與汁血相搏而凝聚成積的過程。因此，從微環境剛性的角度解析“癥積”病機，有助于建立癥積硬度與免疫調控之間的聯系，亦提供軟堅散結調控腫瘤免疫的新思路。

1 ECM重構促進腫瘤“剛性”微環境形成

病變部腫塊堅硬如石，高低不平，狀似巖突，故名巖。巖與癌同[3]，這種腫瘤的硬度改變與臨床觸診的常識相符。夫眾病積聚皆起于虛，虛久血瘀痰凝而為癥瘕。腫瘤微環境中細胞外基質(extracelluar matrix,ECM)的動態重塑是腫瘤剛性調控的關鍵機制。一方面是細胞外基質蛋白的表達水平與相對組成發生改變，另一方面ECM空間拓撲結構與剛性等物理學性質的改變，使腫瘤組織的硬度顯著高于正常組織[4]。

ECM是圍繞著細胞的三維結構，主要有兩類：一類是主要由IV型膠原蛋白、層黏連蛋白、巢蛋白和蛋白聚糖組成的直接與上皮細胞或內皮細胞相互作用的基底膜(basement membrane)；另一類主要由I型和III型膠原蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖、腱糖蛋白組成的間質基質(interstitial matrix)，它構成細胞外基質的主體。結直腸癌(colorectal cancer,CRC)不同分期的ECM與癌細胞E-鈣黏蛋白(E-cadherin,E-cad)表達呈負相關，而與整合素αvβ6的表達正相關，CRC分期越高ECM促進癌細胞上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)的能力越強[5]。間質起源的結締組織生成(desmoplasia)與CRC的預后不良和轉移性復發相關，提示CRC發生發展過程伴隨結締組織生成與纖維化。該過程與《靈樞·百病始生》“溫氣不行，凝氣蘊裹而不散，津液澀滲，著而不去，而積皆成矣”的描述相似。

朱丹溪[6]云：“凡人身上、中、下有塊者，多是痰。”而ECM的過量沉積及其組織形式的異常形成是機體損傷修復而“成塊”的關鍵步驟，因此ECM重構并在腫瘤微環境沉積形成“有形之痰”。丹溪學派醫家認為，痰為津液脾濕所生。我們此前提出脾虛(甚則及腎)是腫瘤微環境的核心病機，脾胃虛損、中氣匱乏、失其健運之常，遂聚濕而生痰[2,7-8]。《肘后備急方》[9]言：“凡癥堅之起，多以漸生，如有卒覺便牢大，自難治也”，表明自癥積之初，其性漸堅，痰凝日久，終致《靈樞·百病始生》之謂：“虛邪之中人也……稽留而不去，息而成積”，終牢大難治，如《外證醫案匯編》 云：“正氣虛則為巖。[10]”

2 CAFs是微環境“硬化”的關鍵細胞組分

腫瘤微環境ECM重構的核心是活化的成纖維細胞，即腫瘤相關成纖維細胞(carcinoma-associated fibroblasts,CAFs)。與靜息成纖維細胞相比，活化的成纖維細胞分泌更高水平的細胞外基質蛋白增殖更快、活性增強。腫瘤中的成纖維細胞是持續激活的，因此腫瘤也被稱為是“無法修復的損傷”[11]。CAFs不斷分泌促進遷移的細胞外基質成分，如膠原蛋白、腱糖蛋白等，結合細胞因子和生長因子等并調控細胞對上述因子的響應[12]；CAFs還可以上調絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶的表達，如賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase,LOX)促進ECM中的膠原與彈性蛋白聚合并穩定ECM；尿激酶型纖溶原激活劑(urokinade-type plasminogen activator,uPA)是纖溶酶酶原激活成纖溶酶必需的；基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase 1,MMP-1)和MMP-3可以降解和重塑ECM，ECM的重塑和膠原蛋白的交聯引起ECM剛性增強[13]。《丹溪心法附余》曰：“凡人頭面頸頰身中有結核，不痛不紅，不作膿者，皆痰注也”[14]，因此CAFs是腫瘤生“痰”之源，所生之痰注逐漸蓄積、隨氣升降、流動不測、黏滯膠著、穢濁腐敗、性趨結聚而致病。

基底膜與間質基質共同決定組織的機械強度[4]。CAFs能夠產生不同的膠原和纖維連接蛋白，是間質基質中合成和沉積ECM所必不可少的；CAFs分泌層黏連蛋白和IV型膠原，為產生基底膜所必需，因此CAFs是腫瘤剛性微環境形成的決定性細胞組分。

腫瘤微環境中的CAF活化，導致ECM沉積、炎癥細胞浸潤和血管生成[15]。《雜病廣要》[16]曰：“血隨氣結，痰亦緣火相附而升，遂合并而成形質。”《丹溪心法·積聚痞塊》[6]云：“氣不能作塊成聚，塊乃有形之物也，痰與食積、死血而成也。”朱丹溪[6]提出“痰挾瘀血，遂成窠囊”，其理論基礎在于痰源于津，瘀本于血，津血互根同源，則痰瘀亦可相互轉化、相兼為病。因此，腫瘤微環境中ECM重塑和血管生成導致痰瘀交結、機械強度漸增，遂作塊成聚，積聚乃生。

3 CAFs募集MDSCs和TAMs促進免疫抑制和ECM重構

活化CAFs上調chemokine (C-C motif) ligand如CCL2、CCL5和CCL7，并分泌多種生長因子如PDGFα/β、VEGF、SDF-1、HGF、MMPs和 IL-6等，與髓樣細胞的募集呈正相關，而與T細胞數量呈負相關。在小鼠肝腫瘤模型，CAFs活化STAT3-CCL2信號通路，通過募集髓源抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)促進免疫抑制[17]，而CAFs參與形成的CRC免疫抑制微環境與不良預后相關。CAFs募集髓單核細胞(myelomonocytic cells)、MDSCs和TAMs在腫瘤微環境聚集，釋放TGF-β1、IL-10等免疫抑制因子，限制T細胞在腫瘤細胞近旁(vicinity)的累積，表明積聚剛性的增強進程，同時是以“本虛”免疫抑制微環境逐步形成并加重的過程。

CCLs招募髓樣細胞和巨噬細胞向腫瘤微環境遷移和聚集，微環境中的MDSCs和TAMs釋放大量強血管生成因子，如VEGF-A、VEGF-C、TNF-α、胎盤生長因子、趨化因子CXCL12、CXCL8和bFGF。TAMs還表達一系列蛋白酶，包括uPA、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-12和彈性蛋白酶等。uPA和MMP能夠重構和降解ECM，降解的ECM引起生長因子的動員并促使血管細胞遷移建立新微環境[18]。因此，CAFs募集免疫細胞在微環境的累積，一方面促進微環境的ECM重構，另一方面則誘導免疫抑制微環境，形成免疫赦免樣區域，是腫瘤生長的沃土。因此，抑制CAFs活化能降低I型膠原蛋白的表達，抑制具有多種抗藥性腫瘤的生長和轉移[19-20]。

腫瘤剛性微環境一方面提升腫瘤內部的組織液壓，降低藥物在腫瘤中的富集利用；另一方面能夠促使TAM從具有免疫清除功能的M1型向免疫抑制的M2型轉化，卻限制了細胞毒性T細胞在微環境的聚集，使腫瘤微環境維持在免疫抑制的狀態，如《局方發揮》云：“自氣成積，自積成痰”[21]，遇瘀血而搏結，導致窠囊之屬，因實致虛限制了腫瘤免疫治療的效果。

4 軟堅散結調節ECM重構改善剛性微環境

《素問·至真要大論篇》曰：“堅者削之”“結者散之”。漢·張仲景即用鱉甲煎丸治療癥瘕，晉·葛洪善用海藻治療癭瘤。清·陳士鐸《石室秘錄》破解散、神效開結散等，均以軟堅散結為治。《雜病源流犀燭》提出：“積聚、癥瘕、痃癖，因寒而痰與血食凝結病也。[22]”朱丹溪[6]云：“凡積病不可用下藥，徒損真氣，病亦不去，當用消積藥，使之融化，則根除矣。”主張咸以軟之，堅以削之，行氣開痰。針對腫瘤，選用咸寒之品軟堅散結以消痰積，旨在緩其堅之性，化其堅之形。

來源于骨髓、淋巴結或脾臟的免疫細胞向腫瘤細胞的募集，參與腫瘤微環境由軟向硬的轉變，也必然涉及機械力的信號改變，因此腫瘤微環境不僅僅是一個化學概念，ECM幾何結構、空間拓撲結構及硬度等物理學特性可以作為機械信號調控腫瘤的生長、侵襲和轉移[23-24]。軟堅散結藥中的硫酸多糖與硫酸糖肽等成分具有軟化腫瘤微環境的作用[25]。基于此，我們檢測了扶正化瘀散結方對小鼠原位CRC移植瘤硬度的作用，發現扶正化瘀散結顯著抑制腫瘤的生長并降低其硬度，軟堅散結藥可能不能有效殺死腫瘤細胞，但可能通過調節機械力信號與ECM重構改善微環境的硬度，使解毒抗癌藥直達病所而抑制腫瘤進展。

5 結語

CAFs的持續活化誘導細胞外基質重塑，微環境剛性增強；ECM的重構誘導整合素的聚集并激活下游信號FAK信號通路，又反過來促進CAFs活化狀態的維持，CAFs與ECM交互調控共同形成腫瘤剛性微環境[26]。“痰之為物，隨氣升降，無處不到”[6]，腫瘤剛性微環境既是腫瘤生長的窠囊，又是發生轉移的根源。因此，應用扶正化瘀散結法通過調整微環境CAFs的活化與ECM重構，改善微環境的剛性，可能是防治腫瘤的侵襲與轉移的有效策略之一。