《整形手術用交聯透明質酸鈉凝膠》標準中質量控制方法的研究進展

于浩 姜愛莉 李敏 付步芳 王召旭

[摘要]透明質酸（Hyaluronic acid，HA）是人體組織成分之一，廣泛存在于人體皮膚、軟骨組織、韌帶以及眼睛玻璃體中，具有良好的生物相容性、親水性、粘彈性及低免疫原性。生物工程生產的交聯透明質酸鈉凝膠具有相似的生物學特性，是目前最常用的注射微整手術填充材料之一。該文首先回顧了注射整形行業的發展歷史，同時分析了交聯透明質酸鈉凝膠在整形行業的應用，包括面部除皺、隆鼻頦、瘢痕修復等部分，重點闡述了整形手術用交聯透明質酸鈉凝膠質量控制的方法，包括交聯劑殘留量、透明質酸鈉含量、溶脹度、蛋白質含量、重金屬含量以及分子量等。結合國內外交聯透明質酸鈉凝膠的研究動態，提出了今后的發展前景。

[關鍵詞]透明質酸;交聯透明質酸鈉凝膠;注射整形;質量控制

[中圖分類號]R622? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2020）12-0185-05

Research Progress of Quality Control Methods in the Standard of Cross-linked Sodium Hyaluronate Gel for Plastic Surgery

YU Hao1，2，JIANG Ai-li1，LI Min1，2，FU Bu-fang2，WANG Zhao-xu2

（1.Yantai University， Yantai 264000，Shandong，China;2.National Institutes for Food and Drug Control， Beijing 102629，China）

Abstract：Hyaluronic acid （HA） is one of the components of human tissues. It is widely present in human skin， cartilage tissues， ligaments， and vitreous eyes.It has good biocompatibility，hydrophilicity， viscoelasticity，and low immunogenicity.The cross-linked sodium hyaluronate gel produced by bioengineering has similar biological characteristics and is currently one of the most commonly used filling materials for injection microsurgery.This article first reviews the development history of the injection plastic surgery industry，and analyzes the application of cross-linked sodium hyaluronate gel in the plastic surgery industry， including facial wrinkle removal， rhinoplasty， scar repair and other parts， focusing on the use of plastic surgery The method of quality control of sodium hyaluronate gel includes the residual amount of crosslinking agent， sodium hyaluronate content， swelling degree， protein content， heavy metal content and molecular weight. Combining the research development of cross-linked sodium hyaluronate gel at home and abroad， the future development prospects are proposed.

Key words：hyaluronic acid;cross-linked sodium hyaluronate gel; injection shaping; quality control

透明質酸（Hyaluronic acid，HA）是由雙糖單位重復排列而成的線性高分子直鏈多糖聚合物，是細胞外基質的重要成分，其分子量可達107Da[1]。由于其高度粘彈性、保濕性以及生物相容性等優勢廣泛應用于眼科顯微手術、關節炎治療、藥物釋放及組織工程等生物材料領域[2]。為賦予HA更強的流變學性能及其抗酶解能力對其進行改性，HA分子中功能羥基、羧基、N-乙酰氨基以及還原末端是可被化學修飾的四個部位。其中，在已報道文獻中最常見的是對羥基和羧基的交聯[3]，常見的交聯方式包括席夫堿反應、硫醇修飾HA以及酶催化交聯HA等[4]。如今，注射整形行業快速發展，利用生物材料來修復老化皮膚是皮膚科和整形外科的常用方法，首選材料即是HA的化學交聯衍生物。較低濃度的交聯透明質酸即可吸水膨脹，在壓力的作用下，交聯透明質酸鈉凝膠流動性以及注射器內推擠力都符合注射填充材料的要求[5]。

自美國食品藥品監督管理局（FDA）于2003年12月批準HA用于面部除皺以來，HA已逐步成為最常用的皮膚填充材料[6-7]。美國整形外科學會（American Society of Plastic Surgeons，ASPS）匯總得出，2018年在美國進行軟組織填充劑注射美容者高達267萬，其中以HA作為軟組織填充劑占比79%以上[8]。面部填充劑主要作用在皮膚靜態皺紋、面部軟組織缺陷及其組織輪廓改善。交聯透明質酸由三維網絡結構支撐，以提供防止透明質酸酶分解的化學屏蔽或活性氧，因此，比未交聯的HA在體內存留時間長，臨床效果可維持18個月左右，且不良反應發生率較低[9]。除此之外，在組織工程技術修復不規則組織器官缺損的解決方案中，可注射交聯透明質酸凝膠的優勢是可配合微創手術、創傷面積小、凝膠可流動性強以及可填滿整個缺損部位等[10]。通過交聯反應拓寬了HA的應用范圍，同時也使得新型交聯產品的應用價值大幅度提升。

1? 注射整形發展歷史

最早的填充注射微整出現在1893年，面部填充材料選擇自體脂肪。優勢是具有較好的生物相容性、穩定性以及多功能性;劣勢是脂肪的分離純化以及融入宿主組織等技術完全依靠醫生的手法，因此難以得到推廣[11]。

20世紀初，注射微整行業取得了首次突破性進展，報道出現在維也納，采用人工合成材料-液體石蠟作為填充注射劑，優勢是來源廣泛，原材料易得;劣勢是生物相容性差，患者開始出現嚴重的異物和肉芽腫反應，致使公眾對注射整形業的強烈不滿[12]。20世紀60年代，面部注射硅油以及合成聚四氟乙烯糊狀注射劑又相繼出現，在美國、德國以及日本廣為流行，但同樣因為材料的生物相容性差，造成嚴重的延遲并發癥被FDA否定[13]。

1981年，FDA批準用于化妝品的第一個注射用填充劑—牛膠原蛋白，成為注射微整的新選擇，優勢是可注射性好，淡化細紋的能力高，劣勢是蛋白含量較高，機體易產生抗原反應，出現過敏癥狀[14]。直到21世紀早期，HA憑借具有獨特的理化性質、生理功能以及良好的生物相容性，逐步在整形美容行業得到廣泛應用。

2? HA在整形手術行業的應用

交聯透明質酸鈉凝膠可有效矯正鼻唇溝，填補額頭、眼周、口周等部位的皺紋，還可矯正淚溝畸形，豐唇、豐耳垂等[15]。復數黏度和彈性模量較大的HA，植入后向組織內擴散較少，且受面部肌肉運動時的外力影響較小，適用于鼻唇溝褶皺、木偶紋等方面的應用[16];彈性模量較小的HA更柔軟，適用于淺表皺紋等美容中應用[17];而復數黏度較小的產品，如：Belotero Balance，則具有良好的分散性，在皮下植入后能夠分布均勻，因此，適用于較薄的萎縮皮膚區域[18]。HA也可與肉毒毒素、富血小板血漿及二氧化碳等聯合注射治療改善面部老化[19]。周衛等[20]證明含有三七成分的HA水凝膠能夠明顯抑制家兔硬膜外瘢痕中環氧化酶-2、轉化生長因子β1及其結締組織生長因子的表達，推測該凝膠能夠抑制纖維化瘢痕形成過程中的炎癥反應且可以降低瘢痕硬度。近年來，由于部分整形機構資歷不足或是操作技術有限，容易出現注射失誤后的并發癥，前期高壓氧治療已逐漸成為HA注射隆鼻術后并發癥的輔助治療，起到減輕炎癥、減小瘀斑面積和促進組織愈合的作用[21]。

3? 質量控制方法研究進展

3.1 交聯劑殘留量的測定：經過近些年的市場整合，交聯透明質酸鈉凝膠技術已趨于平穩和雷同。交聯后的產品能增強其結構強度及抗降解能力，從而延長在體內的維持時間[22]。從交聯劑選擇層面來講，主要采用二乙烯基砜（DVS）和1，4-丁二醇二縮水甘油醚（BDDE），后者占據比例較大。用BDDE交聯修飾后的HA相對DVS具有毒性較低、反應性佳等優勢，逐漸取代DVS作為交聯透明質酸的主要交聯劑。然而，交聯劑化學性質活潑，單體有致突變和致癌的潛在風險，因此在踐行轉化醫學中，為保證臨床應用的安全性，有必要對交聯透明質酸鈉凝膠中的交聯劑殘留量進行嚴格監控。現行行業標準YY/T 0962-2014版《整形手術用交聯透明質酸鈉凝膠》中規定交聯劑殘留量不得大于2μg/g。

葛翠蘭等[23]采用高效液相色譜法對DVS-HA凝膠產品的交聯劑殘留量進行測定，測定含量低于最低檢測限60ng/g，根據方法學驗證，實驗結果可靠，但前期樣品處理較繁瑣。張治云等[24]對交聯透明質酸鈉細胞支架材料中交聯劑殘留量進行測定，將支架材料剪碎后加適量水使其充分溶脹成凝膠，再加乙醇，使交聯透明質酸鈉凝膠形成均勻絮狀沉淀，可充分提取游離的BDDE，本試驗通過色譜條件優化，采用不分流模式，溶液直接進樣，定量限為0.104μg/ml，方法的檢測線、靈敏度都達到相應要求。馮梅等[25]采用氣相色譜法，得到定量限為1.85μg/ml，靈敏度和線性相關性均較差，對比后認為熒光分光光度法簡單準確，靈敏度高，更適用于交聯透明質酸凝膠的質量控制。魏長征等[26]采用氣相色譜法考察BDDE的熱穩定性，同時利用熒光分光光度法測定交聯透明質酸鈉凝膠中BDDE的殘留量。通過分析熒光法檢測BDDE殘留量的影響因素（透明質酸酶及BDDE穩定性）進而改良熒光法，即將透明質酸酶添加到 BDDE 標準溶液中，實測值減去標底值得到交聯劑的含量。改良后的熒光法特異性更強，即尼克酰胺特異性地與環氧化合物中的三元環發生反應生成具有熒光吸收的有色物質，且對應顏色的深淺與環氧化合物的含量成線性相關，由此避免了測定過程中高溫對交聯劑含量的干擾作用，具有更高的準確度、靈敏度，能夠更好地控制產品的生物安全性。

3.2 透明質酸鈉含量的測定：無論何種來源，HA均由葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖按1：1的摩爾比組成，可根據其中葡萄糖醛酸或者氨基葡萄糖的含量來計算HA的含量[27]。張莉等[28]采用高效凝膠色譜法同時測定眼用粘彈劑中透明質酸鈉和硫酸軟骨素鈉的含量，通過凝膠滲透色譜與多角度激光光散射儀聯用確定透明質酸鈉和硫酸軟骨素的分子量，使用親水性凝膠色譜柱和示差折光檢測器，排除其他成分干擾，實現復雜樣品中兩活性成分的測定，該方法簡單易控，準確度高，可用于眼用黏彈劑活性成分的質量控制。微生物來源的透明質酸酶可將HA特異性降解為不飽和雙糖（ΔDiHA），陳玉娟等[29]通過測定供試品中的ΔDiHA得到透明質酸鈉的含量，酶解法結合高效液相色譜法測定具有干擾因素少且檢測結果較為可靠的優勢，但劣勢是操作步驟較為繁瑣。Chen等[30]采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）濁度法對發酵液中透明質酸鈉含量進行測定，透明質酸鈉與CTAB等陽離子表面活性劑產生絡合反應，且在一定濃度范圍內遵循朗伯-比爾定律，該方法準確度較高，然而缺點是實時檢測難度高。李敏等[31]采用改良咔唑法測定重組人溶菌酶滴眼液中透明質酸鈉的含量。對顯色條件進行優化，確定硼砂-硫酸加入量為5ml，水解溫度為100℃，顯色加熱時間為20min，咔唑-乙醇溶液用量為0.2ml，顯色后用冰水浴迅速冷卻代替自然冷卻的方法，獲得了最佳的測定條件。湯祥忠等[32]采用紫外-可見分光光度法測定高吸水性止血材料中透明質酸鈉含量，將樣品充分溶解于水中，過濾后取濾液，分別加四硼酸鈉硫酸溶液和咔唑乙醇溶液，采用紫外-可見分光光度法，在600nm波長處測定吸光度，以葡萄糖醛酸的濃度對相應的吸光度計算回歸方程，通過測定葡萄糖醛酸的含量間接確定透明質酸鈉的含量。與對溫度要求較高的阿利新藍染料法、檢測條件嚴苛的高效液相色譜法、價格昂貴且耗時較長的定量試劑盒法相比，改良咔唑法條件限定較少、顯色速度快、準確度高。該方法適合含葡萄糖醛酸分子在酸性條件下水解的多糖類化合物，歐洲藥典以及國家藥品標準中都采用此種方法作為含量檢測的法定方法，適合作為整形手術用交聯透明質酸鈉凝膠中透明質酸鈉含量測定的方法。

3.3 溶脹度的測定：凝膠的溶脹度比率是指凝膠吸水膨脹后與吸水前的比重，它是決定HA顆粒降解的主要因素，溶脹比與凝膠的顆粒結構有關。張?等[33]將制備的水凝膠凝固成膠體后，稱其質量，將凝膠保持在37℃恒溫PBS水浴溶液中，放置過夜，使其自然溶脹，從PBS溶液中取出水凝膠，用濾紙吸去表面液體，并再次稱其質量，以凝膠溶脹的重量與凝固成膠體的凝膠質量之比作為溶脹比。Shimojo等[34]采用二乙烯基砜作為交聯劑制備的交聯透明質酸鈉凝膠，溶脹比為HA/DVS微粒的溶脹重量與凝膠干重的比。James等[35]通過測定原樣品水凝膠的質量與在F12培養基中浸泡24h（平衡）后樣品的干燥水凝膠之比確定溶脹度。在凝膠濃度一定的情況下，溶脹度的大小雖然不能準確得到交聯修飾度的數值，但能一定程度反映交聯修飾度[36]。

3.4 蛋白質含量的測定：透明質酸鈉中常見雜質包括蛋白質、核酸及硫酸軟骨素等，少量雜質并不影響其在成品中的作用，但是原料中若含有較多的蛋白質（1%），會引起機體產生抗原反應，易出現致敏癥狀[37]。因此，需要對其進行研究并嚴格控制終產品中的蛋白殘留量。蛋白質測定方法較多，常見的包括凱氏定氮法、雙縮脲法、紫外吸收法、福林酚法以及考馬斯亮藍法等[38-39]。

1976年，Bradford利用考馬斯亮藍與蛋白質中的堿性氨基酸和芳香族氨基酸結合形成藍色復合物的原理，確定了定量檢測微量蛋白濃度的考馬斯亮藍法[30]。林玉珍[40]對測定透明質酸鈉中作為雜質的蛋白含量測定方法進行研究，對比分析了考馬斯亮藍法和福林酚法的檢測結果和理論機制，得出福林酚法在檢測過程中會受到多肽的干擾，HA樣品中存在除蛋白以外的多肽類雜質，檢測過程中也會和福林酚發生反應，致使測定結果不可靠;而考馬斯亮藍法靈敏度高、準確度高且操作簡便，測定蛋白質的回收率接近100%，且通過本結果還證實HA對考馬斯藍法不存在干擾，更適合作為整形手術用交聯透明質酸鈉凝膠中蛋白含量測定的方法。研究表明，福林酚法主要適用于蛋白質為主要成分的供試品，而考馬斯藍法則適用于蛋白質為少量成分的供試品[41]。趙卓等[42-43]在實驗操作過程中，模擬不同條件的光源，得出考馬斯亮藍分子結構對光照敏感，光照強烈會使顯色劑吸收光譜發生改變，造成檢測結果出現較大波動，因此，需采用棕色試劑瓶且避光測定。同時，研究證明在1～100mg/ml蛋白質濃度測定范圍內，室溫20℃、孵育20～30min時測定蛋白含量較為穩定，并且蛋白濃度越高，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度過程中抵御各類外在干擾因素的能力越強。考馬斯亮藍法蛋白質與染料結合后產生的復合物顏色穩定，消光系數高，操作簡便且對儀器要求單一[44]。然而該方法操作過程中需要嚴格注意一些細節，否則直接影響測定結果，例如：考馬斯亮藍G250與石英比色皿（成分：二氧化硅）會產生強烈的結合，因此，本實驗需使用玻璃或塑料比色皿[45]。

3.5 重金屬的測定：重金屬通常是指在一定條件下能與硫代乙酰胺或者硫化鈉作用而顯色的金屬雜質，它也是交聯透明質酸鈉凝膠中必須嚴格控制的雜質之一。人體中重金屬含量若積累到一定程度，輕則頭暈惡心，重則神經系統紊亂，甚至有致癌的可能。鉛是重金屬中毒性較大的，容易在體內積蓄中毒，且在制劑生產過程中接觸機會較多，因此，質量標準中對重金屬檢測時以鉛的含量為代表加以控制。曲建全[46]采用重金屬限度檢查法，以硫代乙酰胺試液作為顯色劑，首先將透明質酸鈉供試品灼燒破壞，然后取其熾灼殘液，經過一定的處理后在酸性溶液中進行顯色。該方法為《中華人民共和國藥典》2015年版四部中重金屬檢查法第二種方法，利用重金屬雜質與硫代乙酰胺試液反應生成有色的硫化物，與一定量的標準硝酸鉛溶液經同法處理后所顯顏色進行比較，為半定量檢測方法[47]。測定過程中熾灼殘渣加入硝酸處理后，必須將其蒸干，直至氧化氮蒸氣除盡為止，否則會使硫代乙酰胺水解生成硫化氫，影響測定結果。

3.6 分子量的測定：分子量是表征HA最基本的特征之一，因HA雙糖單位數量不一，造成分子鏈長短有一定差異，所以其分子量的大小有所不同。不同分子量HA的物化性質也有一定差別，決定了其在化妝品、保健、醫療行業的應用范疇。HA是一種非均一的物質，各種方法測定的分子量值都為平均相對分子量。方法包括特性黏度法、高效凝膠滲透色譜法、光散射法及超速離心法等。特性粘度法可以合理預估非純品HA的分子量，廣泛應用于HA純品的分子量測定[48-49]。Karlsson等[50]選擇梯度洗脫的方式，利用陰離子交換色譜法，測定HA的峰值分子量，且對其分子量分布進行分析，設置UV檢測波長為210nm，研究得出，在分子量0.1×106～5×106范圍內，HA峰值分子量精密度良好，分子量分布較為合理。然而該方法易受雜質干擾，對純度要求高。秦東等[51]選擇近紅外漫反射光譜法測定HA分子量，采用最小二乘法回歸多元校正法對46個HA粉體樣品在近紅外光譜選定區域進行了分析，相關參數以及卡方檢驗得到的近紅外光譜重復性都在允許誤差范圍內，認為該方法快速測定HA分子量可行。劉莉莉等[52]采用多角度激光光散射儀與體積排阻色譜法聯用（MALLS-GPC）為絕對表征提供了新思路，由于光散射測量不依附于泵速分子構象或聚合物標準，可直接獲得絕對分子量及相應數據，適用于整形手術用交聯透明質酸鈉凝膠產品的表征。

4? 展望

早期的面部除皺手術以切除松弛皮膚為主要內容，隨著面部解剖層研究的發展，面部除皺從皮膚逐漸深入到SMAS、脂肪組織以及骨膜等部分，人們逐漸了解到面部衰老不僅是皮膚軟組織的松弛，也是容量的缺失，需要外源填充劑的注射以延緩衰老造成的皺紋和面部凹陷[53]。常見的面部填充劑包括HA、左旋聚乳酸以及膠原蛋白等。

HA在改性、復合方面的研究層出不窮，為美容整形行業提供各類特征、適合不同臨床需求的產品，由此決定了此類HA衍生物在醫學領域中應用的廣泛性。然而整形手術用交聯透明質酸鈉凝膠產品的應用仍舊處于一個初步開發階段，交聯產物的性質仍需進一步研究，產品制劑中交聯劑的劑量、毒性以及其他成分的添加量也需進行有效的質量控制，從而推動整形行業的不斷發展。通過化學修飾/交聯得到的凝膠在機械性能和抗降解能力方面都有所提升，對于注射整形持久性和創傷愈合等方面的應用提供了保障，未來技術革新所探究的新的交聯方式將以簡易性、可控性和智能性逐步取代傳統的交聯方式，應用范疇也會相繼擴大。同時由于中國化妝品行業起步較晚，部分原料仍依靠進口，因此，開發高效、安全無毒、具有新型功能的HA衍生物成為中國化妝品行業發展進程中亟待解決的難題之一。

（致謝：衷心感謝蒙一純博士在本綜述撰寫期間給予得細致指導與精心點撥！）

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[收稿日期]2020-03-02

本文引用格式： 于浩，姜愛莉，李敏，等.《整形手術用交聯透明質酸鈉凝膠》標準中質量控制方法的研究進展[J].中國美容醫學，2020，29（12）：185-189.