富血小板纖維蛋白對兔耳軟骨移植成活情況的影響

高堂俊 趙宇 吳亮亮 賈大平 柳芳

[摘要]目的：研究自體富血小板纖維蛋白（Platelet-rich fibrin，PRF）對兔耳軟骨移植后成活的影響，為臨床應用提供證據。方法：選取16只新西蘭大白兔，于兔雙耳對稱處設計并剝離出大小、形狀相似，重量為80mg的耳軟骨塊，雙側耳軟骨塊隨機分為對照組與實驗組，對照組耳軟骨塊直接置入兔背部左側淺筋膜腔隙內，實驗組耳軟骨塊聯合PRF共同置入兔背部右側淺筋膜腔隙內。分別于2周、4周、8周、12周取材進行大體觀察、重量比較及統計學分析、染色觀察（HE染色、番紅〇染色、阿利新藍染色）。結果：通過大體觀察和軟骨重量可見：2～4周耳軟骨塊重量增加，8～12周耳軟骨塊重量減小，各時間點實驗組耳軟骨塊重量均大于對照組，兩組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。染色觀察可見：各時間點在相同顯微倍數、同一視野下實驗組軟骨細胞明顯多于對照組，其中新生軟骨細胞也多于對照組。實驗組異染性軟骨基質、藍色的糖胺聚糖均更明顯。結論：自體富血小板纖維蛋白能夠促進兔耳軟骨移植后的存活。

[關鍵詞]富血小板纖維蛋白;鼻整形術;耳軟骨移植;軟骨吸收;軟骨成活;細胞因子

[中圖分類號]R622? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2020）12-0097-05

Effect of Platelet-rich Fibrin on the Survival of Rabbit Ear Cartilage Transplantation

GAO Tang-jun，ZHAO Yu，WU Liang-liang，JIA Da-ping，LIU Fang

（Department of Plastic Surgery，the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022，Anhui，China）

Abstract： Objective? To study the effect of autologous platelet-rich fibrin（PRF） on the survival of rabbit ear cartilage after transplantation， so as to provide evidence for clinical application. Methods? Sixteen New Zealand white rabbits were selected to design and strip out ear cartilage with similar size and shape and weight of 80mg on the symmetry of both ears. Both sides of ear cartilages were randomly divided into the control group and the experimental group. The piece of ear cartilage in control group was transplanted directly into the left side of the superficial fascia lacuna on the back of the rabbit ， the piece of ear cartilage in experimental group combine with PRF was transplanted into the right side of superficial fascia lacuna on the back of the rabbit. General observation， weight comparison and statistical analysis and staining which includ hematoxylin-eosin staining， saffron O staining and alcian blue staining were performed after 2 weeks， 4 weeks， 8 weeks and 12 weeks. Results? General observation and comparison of cartilage weight showed that： the weight of ear cartilage increased at 2-4 weeks， and decreased at 8-12 weeks. At each observation time， the weight of ear cartilage in the experimental group was greater than that in the control group. And the difference between the two groups was statistically significant （P<0.05）. Staining observation showed that：at each observation time， the chondrocytes in the experimental group were significantly more than those in the control group under the same microscopic scale and the same visual field. The heterochromatic cartilage matrix and blue glycosaminoglycan were more obvious in the experimental group. Conclusion? Autologous platelet-rich fibrin can promote the survival of rabbit ear cartilage after transplantation.

Key words： platelet-rich fibrin（PRF）; rhinoplasty; ear cartilage transplantation; absorbtion of cartilage; survival of cartilage; cytokines

整形美容行業近年來得到快速發展，其中鼻整形手術成為熱門手術之一。鼻整形手術通常應用的手術方式有鼻假體置入術、鼻假體聯合耳軟骨隆鼻術、肋軟骨隆鼻術等[1]。由于單純假體置入容易引起感染、假體外露、包膜攣縮、透光等并發癥[2]，肋軟骨隆鼻手術存在血胸、氣胸、肋骨骨折、瘢痕形成甚至胸廓畸形等風險[3]，目前鼻假體聯合耳軟骨隆鼻術最為常用。然而，在臨床工作中，術者發現耳軟骨移植術后易出現軟骨成活不佳、被吸收等問題，導致患者對術后遠期鼻部形態不滿意。因此，改善耳軟骨移植后存活、減少其吸收成為鼻整形手術中急需解決的一大問題。

富血小板纖維蛋白（Platelet-rich fibrin，PRF）是由Choukroun等在2001年發現的第二代血小板濃縮物[4]。PRF能夠有效模擬生理狀態下血凝塊中的纖維蛋白形成過程，避免了免疫排斥和交叉感染的發生，有很好的生物相容性[5]。本課題組通過前期研究發現，PRF能夠促進潰瘍創面愈合[6]，在骨缺損修復中可以誘導骨組織再生[7]，在脂肪移植中有促進脂肪細胞存活的作用[8]。為進一步探究PRF在耳軟骨移植方面是否同樣具有良好的應用效果，本實驗制作了新西蘭大白兔自體耳軟骨異位移植模型進行相關實驗研究。

1? 材料和方法

1.1 研究對象：12～16周生長雄性新西蘭大白兔16只，體重3.2～3.5kg，均購自安徽醫科大學實驗室，清潔級，普通環境下單籠飼養，遵照安徽醫科大學第一附屬醫院實驗動物飼養與使用規定，動物購置后飼養3周。

1.2 實驗材料：7%水合氯醛購自青島宇龍海藻有限公司;2%鹽酸利多卡因注射液購自上海朝暉藥品有限公司;鹽酸金霉素眼膏購自北京雙言制藥有限公司;4%多聚甲醛固定液購自博士德生物技術有限公司;HE染色試劑購自珠海BASO生物技術有限公司;番紅〇染色試劑、阿利新藍染色試劑購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組：將每只實驗兔雙側耳軟骨隨機分為對照組與實驗組，對照組與實驗組標本數均為16。

1.3.2 PRF制備：自實驗兔耳中動脈以采血針抽取10ml血置入無菌玻璃干管中，立即以3 000r/min離心10min，可見血液分為三層，上層清亮液體為貧血小板血漿層，中層半透明凝膠狀物質為PRF凝膠，底層為破碎紅細胞層（見圖1）。將試管放入4℃冰箱中冷藏30min后取出，取試管中層凝膠樣物質放置于無菌紗布上，輕輕按壓擠出水分，使PRF成膜狀，PRF膜片即制備完成，備用。

1.3.3 制作兔耳軟骨移植模型：將實驗兔稱重并記錄，7%水合氯醛注射液按3ml/kg自兔耳緣靜脈麻醉，麻醉成功后將兔雙側耳、頸背部剃毛備皮。于實驗兔雙側耳背面對稱部位標記擬取軟骨范圍，盡量避開耳緣靜脈及中動脈，防止剝離過程損傷血管。標記完成后，常規消毒鋪巾，以稀釋后濃度為0.5%的利多卡因溶液沿標記線行皮下注射起到局部腫脹及麻醉作用，腫脹完成后以11號尖刀片劃開皮膚，用剝離子逐步剝離開軟骨與皮膚，剝離完畢后以組織剪小心剪下軟骨，并去除軟骨表面軟骨膜，將兩側軟骨修剪至大小形狀相似、重量為80mg的軟骨塊（見圖2）。自兔背部皮膚以后正中線做兩側對稱小切口至淺筋膜層，分離出淺筋膜腔隙，將對照組耳軟骨塊直接置入左側背部淺筋膜腔隙內，將制備好的PRF膜片和實驗組耳軟骨塊共同放入右側背部淺筋膜腔隙內，用絲線逐層縫合手術切口，術區涂抹鹽酸金霉素眼膏后處于暴露狀態，待麻醉恢復后放入原籠中，使之自由活動，定期觀察術區情況。

1.4 觀察指標

1.4.1 一般情況及組織大體外觀觀察：術后觀察實驗兔活動、進食及手術切口的感染情況，于術后2周、4周、8周、12周以空氣針靜脈注射各處死4只實驗兔，取出移植耳軟骨塊觀察對照組與實驗組耳軟骨塊增大或減小情況。

1.4.2 耳軟骨塊重量比較：于各時間點將移植耳軟骨塊取出后去除表面包膜進行稱重并記錄。

1.4.3 組織學觀察：將移植耳軟骨塊標本置于4%多聚甲醛固定液中進行固定，脫鈣、梯度乙醇脫水、石蠟包埋后，切片進行HE染色、番紅〇染色、阿利新藍染色，在光鏡下對標本進行觀察，了解軟骨細胞成活、新生軟骨細胞數量及隨時間變化等情況。

1.5 統計學分析：數據采用SPSS 23.0統計軟件進行統計學分析。先經Levene齊性檢驗方差滿足齊性要求。軟骨塊重量經過單因素方差分析，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，數據以均值±標準差（x?±s）表示，P<0.05為差異有統計學意義。

2? 結果

2.1 一般情況及大體觀察：所有實驗兔在麻醉完全恢復后均能正常活動及飲食，無死亡，均進入結果分析。實驗兔耳部及背部手術切口均未出現感染，于擬定時間取出移植耳軟骨塊觀察，見各組移植耳軟骨塊表面光滑，邊界清晰，2～4周時可見兩組耳軟骨塊均增大，其中實驗組增大更明顯，8～12周兩組耳軟骨塊均有所減小，其中對照組減小更為明顯。見圖3。

注：A～D.對照組分別于2周、4周、8周、12周取出的移植耳軟骨塊;E～H.實驗組分別于2周、4周、8周、12周取出的移植耳軟骨塊

2.2 耳軟骨塊重量比較：由表1可知，2～4周時耳軟骨塊重量增加，8～12周時耳軟骨塊重量減少，各時間點實驗組耳軟骨塊重量均大于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）與大體觀察結果相符。由此可知，PRF在術后12周內可以促進兔耳軟骨移植后成活，減少其吸收。

2.3 組織學觀察：對照組：2周時于耳軟骨塊邊緣出現新生軟骨細胞，其體積較小;4周、8周時見新生軟骨細胞形態逐漸增大、數量逐漸減少，12周時幾乎無新生軟骨細胞存在。實驗組：2周時于耳軟骨塊邊緣出現大量新生軟骨細胞，其體積小、形態不規則呈多形性、排列紊亂;4周、8周時新生軟骨細胞增大，形態趨向成熟，排列較前規則;12周時可見組織新生軟骨細胞較2周時減少，但仍存在明顯新生軟骨細胞。

實驗組與對照組相比：各取材時間點在相同顯微倍數、同一個視野下實驗組軟骨細胞明顯多于對照組，其中新生軟骨細胞也多于對照組（見圖4）;在番紅〇染色中，實驗組與對照組均有明顯異染性軟骨基質，實驗組異染性軟骨基質更多（見圖5）;在阿利新藍染色中，可見實驗組藍色的糖胺聚糖較對照組更明顯（見圖6）。

3? 討論

鼻假體聯合耳軟骨隆鼻術雖因其具有軟骨獲取簡單、損傷較小、術后并發癥少等優點而得到廣泛應用，但仍然存在著軟骨成活不佳、被吸收等問題。耳軟骨移植后被吸收的原因目前尚不明確，廖俊琳等[9]通過研究提出軟骨吸收的原因可能為：①軟骨塊脫離軟骨膜保護后缺乏營養供應;②自身抗原的暴露，被軟骨基質保護而未被機體識別的軟骨細胞暴露于免疫系統，免疫系統激活后發生清除作用。為進一步解決軟骨移植后被吸收的問題，有學者通過動物實驗研究發現脂肪干細胞與軟骨顆粒混合、使用人類羊膜包裹軟骨可以減少軟骨吸收[10]，但由于脂肪干細胞培養復雜、人類羊膜獲取困難等原因限制了其臨床應用。

PRF是一種富含纖維蛋白、白細胞和大量生長因子的第二代血小板濃縮物。在電鏡下呈現出三分子立體疏松網格狀結構，類似于天然血凝塊，其疏松的結構和較大的空隙有利于細胞因子的留存、細胞生長及移行，從而延長細胞因子的釋放和作用時間[11]。PRF活化后緩慢釋放出多種細胞因子，如轉化生長因子-β、血小板源性生長因子和血管內皮生長因子等[12]。多種生長因子聯合作用可提高軟組織修復能力，減輕炎癥反應和水腫[13]，促進軟骨細胞增殖生長以及軟骨組織細胞外基質生成[14]，此外，其還可以誘導骨間質干細胞增殖分化，提高成骨細胞蛋白激酶和骨保護素表達，促進成骨細胞增殖和分化及新骨形成能力[15-16]。國內目前對PRF的研究主要集中于牙周組織及軟骨缺損修復等方面，如PRF聯合引導骨再生技術有利于促進牙周病頜骨缺損患者植骨治療后骨組織修復及新生[17];PRF聯合自體軟骨顆粒能夠有效修復和縮小軟骨缺損[18]。然而，PRF在鼻整形手術方面的應用尚無文獻報道。

在本研究中，課題組制作了兔自體耳軟骨異位移植模型，即將兔雙側耳軟骨塊隨機分為對照組和實驗組，分別將單純耳軟骨塊、PRF聯合耳軟骨塊移置入背部淺筋膜腔隙內，并在不同時間點取出耳軟骨塊進行大體觀察、重量比較并進行統計學分析和組織學觀察。結果表明，PRF在耳軟骨移植術后12周內可有效減少耳軟骨塊吸收，促進耳軟骨塊成活。課題組結合相關文獻分析后認為其機制可能有：①PRF釋放血管內皮生長因子促進新生血管形成進而為移植耳軟骨提供營養;②多種細胞因子共同作用減輕炎癥反應從而降低了因周圍組織水腫對移植耳軟骨產生的擠壓應力。本實驗亦存在不足需要改進之處：①由于時間限制，在本實驗中未對以上所述可能的機制進行相關實驗驗證;②本次實驗最長取材時間點為12周，12周后兩組耳軟骨塊重量將如何變化尚不可知;③PRF制備需要新鮮血液，單次抽取血液量與制備出PRF量非正相關，因此限制了PRF在臨床上的單次大量應用。在后續研究中本課題組將進一步完善對機制的研究，并探究PRF的保存方法，以期為臨床開展更加完善的鼻整形手術提供新的理論依據。

綜上所述，自體富血小板纖維蛋白可以在耳軟骨移植術后12周內減少耳軟骨吸收并促進其成活，并且因其具有抗感染、減輕炎癥反應和水腫的作用，可以考慮將其應用于耳軟骨移植鼻整形術中以維持鼻部形態，提高患者滿意度。

[參考文獻]

[1]顧天一，王克明，馬繼光.鼻整形植入材料的優缺點及進展[J].中國美容整形外科雜志，2019，30（9）：569-573.

[2]Kim IS.Augmentation rhinoplasty using silicone implants[J].Facial Plast Surg Clin North Am，2018，26（3）：285-293.

[3]Ho OYM，Ku PKM.Rhinoplasty outcomes and trends[J].Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg，2019，27（4）：280-286.

[4]Dohan DM，Choukroun J，Diss A，et al.Platelet-rich fibrin （PRF）：a second-generation platelet concentrate Part Ⅱ： technological concepts and evolution[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2006，101（3）：e37-44.

[5]Dohan DM，Choukroun J，Diss A，et al.Platelet-rich fibrin （PRF）：a second-generation platelet concentrate Part Ⅱ： platelet-related biologic features[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2006，101（3）：e45-50.

[6]汪新偉，榮潔琳，蔣思靜，等.富血小板纖維蛋白在治療糖尿病兔皮膚潰瘍中的實驗研究[J].安徽醫科大學學報，2017，52（7）：983-987.

[7]蔣思靜，榮潔琳，汪新偉，等.自體骨聯合富血小板纖維蛋白在修復牙槽嵴裂中的臨床應用[J].安徽醫科大學學報，2018，53（5）：805-808.

[8]柳芳，趙宇，馬莉，等.改良型PRF與普通型PRF在脂肪移植應用中的實驗對比研究[J].中國美容醫學，2019，28（11）：82-85.

[9]廖俊琳，周建大.自體顆粒軟骨在鼻整形中的研究應用進展[J].中國美容醫學，2015，24（15）：78-81.

[10]Motamed S，Mohammadi Torbati P，Zaferani Arani H，et al.Effects of the human amniotic membrane on the cartilage graft： prognosis and absorption in white rabbits[J].World J Plast Surg，2019，8（2）：219-228.

[11]Dohan Ehrenfest DM，Del Corso M，Diss A，et al.Three-dimensional architecture and cell composition of a Choukroun's platelet-rich fibrin clot and membrane[J].J Periodontol，2010，81（4）：546-555.

[12]Dohan Ehrenfest DM，Pinto NR，Pereda A，et al.The impact of the centrifuge characteristics and centrifugation protocols on the cells， growth factors， and fibrin architecture of a leukocyte- and platelet-rich fibrin （L-PRF） clot and membrane[J].Platelets，2018，29（2）：171-184.

[13]Strauss FJ，Nasirzade J，Kargarpoor Z，et al.Effect of platelet-rich fibrin on cell proliferation， migration， differentiation， inflammation， and osteoclastogenesis： a systematic review of in vitro studies[J].Clin Oral Investig，2020，24（2）：569-584.

[14]Tang X，Chen F，Lin Q，et al.Bone marrow mesenchymal stem cells repair the hippocampal neurons and increase the expression of IGF-1 after cardiac arrest in rats[J].Exp Ther Med，2017，14（5）：4312-4320.

[15]Ju X，Xue D，Wang T，et al.Catalpol promotes the survival and VEGF secretion of bone marrow-derived stem cells and their role in myocardial repair after myocardial infarction in rats[J].Cardiovasc Toxicol，2018，18（5）：471-481.

[16]Choukroun J，Diss A，Simonpieri A，et al.Platelet-rich fibrin （PRF）： a second-generation platelet concentrate Part IV： clinical effects on tissue healing[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2006，101（3）：e56-60.

[17]謝紅幗，姚琴，盧驍鵬，等.富血小板纖維蛋白聯合引導骨再生技術治療牙周病頜骨缺損[J].中國新藥與臨床雜志，2019，38（8）：489-493.

[18]王秀，張正文，謝鋒.富血小板纖維蛋白聯合自體軟骨顆粒修復兔耳軟骨缺損[J].中國美容醫學，2017，26（12）：56-60.

[收稿日期]2020-03-20

本文引用格式：高堂俊，趙宇，吳亮亮，等.富血小板纖維蛋白對兔耳軟骨移植成活情況的影響[J].中國美容醫學，2020，29（12）：97-101.