冷藏和冰藏條件下大菱鲆品質變化與蛋白質氧化相關性

鄒朝陽,趙峰, 歐帥,蘇志衛, 牟偉麗, 劉萌, 周德慶*

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306) 2(中國水產科學研究院黃海水產研究所青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室，山東 青島，266071) 3(青島益和興食品有限公司，山東 青島，266000)4(蓬萊匯洋食品有限公司，山東 蓬萊，265600)

大菱鲆(Scophthatmusmaximus)，其英文名為turbot，在中國被音譯為“多寶魚”，俗稱歐洲比目魚。是我國北方沿海重要的養殖經濟魚種之一[1]。2017年我國鲆魚類養殖總產量達到10.62萬t[2]。

目前國內外對肉類蛋白質氧化的研究多集中在畜禽肉上[7-8]，而在蛋白質氧化對魚類等水產品品質影響方面的研究就少。本文以大菱鲆為研究對象，通過測定感官評分、持水性、質構、肌原纖維蛋白羰基含量、總巰基含量、二硫鍵含量和表面疏水性等指標，并進行相關性分析，探明貯藏過程中蛋白質氧化對大菱鲆魚肉品質變化的影響機理，以期為魚肉品質變化機制研究及魚類保鮮加工提供依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活大菱鲆，2018年5月購于青島市膠南大場養殖基地，體質量為(1±0.2)kg/條，體表富有光澤、黏液透明、眼球飽滿，有水充氧保活運回實驗室。

鹽酸胍、Na2HPO4、NaH2PO4、乙二胺四乙酸(EDTA)、1-苯奈氨-8-磺酸(ANS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、NaCl均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

UV1102Ⅱ紫外分光光度計，上海天美科學儀器有限公司；BSA2202S電子天平，北京賽多利科學儀器有限公司；Neofuge 15R高速冷凍離心機，上海力申科學儀器有限公司；TA-XT plus型質構分析儀，英國Stable MicroSystem公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理方法

取鮮活大菱鲆放血宰殺后，用刀沿大菱鲆背部和腹部脊柱方向從頭到尾劃開，將魚骨兩側魚片取下，在尾部魚肉和魚皮分界處用刀割開，將魚皮慢慢剝離，取魚片(85±10) g，用去離子水清洗后瀝干，放入聚氯乙烯袋中后密封。所有魚片隨機分為2組，分別進行冷藏(4 ℃)和冰藏(0 ℃)，每隔2 d隨機選取3袋樣品進行檢測，根據感官評分結果來確定實驗周期。

1.2.2 感官評價

參考王尊等[9]的方法略有改進。10人組成感官評定小組，根據大菱鲆魚片的色澤、氣味、組織形態和肌肉彈性打分評定，最高分和最低分分別為5分和1分，綜合得分2分以下的則代表為感官不可接受。

表1 大菱鲆魚片感官評定評分標準Table 1 Sensory score standards for turbot fillets

1.2.3 質構的測定

參照林婉玲等[10]的方法，將樣品切成2 cm×2 cm×1 cm規格，使用質構分析儀進行測定，每組樣品做6個平行。

1.2.4 持水性的測定

1.2.4.1 蒸煮損失率的測定

參考張遠等[11]的方法略作修改，將樣品切成2 cm×2 cm×1 cm規格，稱取質量(M1)后裝入蒸煮袋，85 ℃水浴15 min，樣品的質量(M2)于蒸煮后冷卻到室溫后再進行稱重。按照公式(1)進行蒸煮損失率的計算：

(1)

1.2.4.2 滴水損失率的測定

參考張遠等[11]的方法略作修改，將樣品切成2 cm×2 cm×1 cm的規格，稱取質量(M1)，隨后用細鐵絲將樣品的一端鉤住，放置到充空氣的密封袋內，保持樣品垂直向下，不得接觸袋子的內壁，密封后，4 ℃靜置24 h，取出樣品再次稱重(M2)。滴水損失率的計算如公式(2)：

(2)

1.2.5 肌原纖維蛋白的提取與幾個相關指標測定

1.2.5.1 肌原纖維蛋白的提取

參考CHIN等[12]和PARK等[13]的方法略作改進，取絞碎魚肉3 g，加入15 mL10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.2)，8 000 r/min冰浴均質90 s，4 ℃下10 000 r/min離心15 min，取沉淀，加入5倍10 mmol/L Tris-HCl緩沖液(含0.6 mol/L NaCl，pH 7.2)，4 ℃下10 000 r/min離心15 min，上清液即為所需肌原纖維蛋白樣品，用于下述指標測定分析。

1.2.5.2 羰基含量的測定

參照李學鵬等[14]的方法進行測定。

1.2.5.3 總巰基含量測定

參照趙兵等[15]的方法進行測定。

1.2.5.4 二硫鍵含量的測定

參考THANNHAUSER等[16]的方法，調整蛋白質濃度為5 g/L，取0.2 mL蛋白液與5 mL新鮮配制的NTSB溶液混合，室溫下避光反應30 min，然后在412 nm下測定吸光度值(A)，二硫鍵含量的計算公式如公式(3):

(3)

式中:A為波長412 nm處的吸光度；n為稀釋倍數；ε為摩爾吸光系數13 600/(L·mol·cm)。

1.2.5.5 表面疏水性的測定

參考CHEIH等[17]的方法。向1 L 4 g/L肌原纖維蛋白溶液中加入1 g/L 200 μL溴酚藍鈉(BPB)。空白組用20 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)替代。室溫振蕩10 min，5 000 r/min離心15 min。取上清液，將其10倍稀釋，于 595 nm處測吸光度。疏水性用BPB結合量表示如公式(4)：

(4)

式中：A空白，空白組595 nm處吸光之；A樣品，冷藏組或冰藏組樣品595nm處的吸光度。

1.3 數據分析

采用SPSS 18.0和Origin 8.5軟件對數據統計分析和作圖，數據分析采用方差分析(One-way ANOVA)進行顯著性分析，P>0.05表示差異性不顯著，P<0.05表示差異性顯著，P<0.01表示差異性極顯著。

2 結果與分析

2.1 冷藏和冰藏條件下大菱鲆魚片感官評分的變化

大菱鲆宰殺后，由于內源水解酶和外源微生物的作用，導致肌肉組織發生腐敗變質。在這個過程中，魚肉的色澤、氣味和組織結構都會發生顯著性變化。感官評價是通過人的感覺來鑒別魚肉品質變化的一種最直觀的評價方法[18]。由圖1可以看出，隨著貯藏時間的延長，冷藏和冰藏條件下大菱鲆魚片感官評分呈持續下降趨勢。貯藏前4 d，2組樣品的感官評分差異不顯著(P<0.05)，從貯藏第6天開始出現明顯差異，冷藏組樣品的感官評分下降速度明顯快于冰藏組，相同貯藏時間內冷藏魚片的感官評分低于冰藏魚片。冷藏組和冰藏組樣品分別在第8天和第12天時感官不可接受，此時，大菱鲆魚片表面光澤暗淡、腥臭味較為強烈、肌肉組織松散且無彈性。崔正翠等[19]通過感官評價發現大菱鲆在0 ℃和3 ℃貯藏時其較好品質時間分別433 h和197 h，與本實驗的結果相近。因此4 ℃冷藏魚片和0 ℃冰藏魚片的實驗周期分別設定為10 d和14 d。

圖1 冷藏和冰藏條件下大菱鲆魚片感官評分的變化Fig.1 Change in sensory evaluation score of turbot fillets during under refrigerated and ice storage

2.2 冷藏和冰藏條件下大菱鲆魚片持水性的變化

持水性(water binding capacity or water holding capacity，WHC)是指肌肉組織在貯藏和加工等過程中保持其水分的能力[11]。由圖2可以看出，冰藏和冷藏條件下大菱鲆魚片的蒸煮損失率和滴水損失率均隨貯藏時間的延長而逐漸上升，表明2組樣品的持水性均呈下降的趨勢。主要因為動物死后，肌糖原酵解產生乳酸，pH值下降，肌肉蛋白束縛水分的能力減弱，同時肌肉收縮，導致水分從肌肉中擠出[20]。也有研究表明魚肉蛋白在貯藏過程中會發生變性及降解，其空間網絡結構被破壞，導致肌肉的保水能力下降[21]，而低溫能夠在一定程度上抑制蛋白質變性，從而降低魚肉水分的損失。鄧星星等[22]研究發現白烏鱧肌肉的蒸煮損失率隨貯藏時間的延長而升高，并且低溫有利于維持肌肉的持水力。王曉君等[23]也發現相同貯藏時間內，0 ℃貯藏下大口鲇魚肉的持水性要優于4 ℃。

A-冷藏組滴水損失率；B-冰藏組滴水損失率；C-冰藏組蒸煮損失率；D-冷藏組蒸煮損失率圖2 冷藏和冰藏條件下大菱鲆魚片蒸煮損失率和滴水損失率的變化Fig.2 Change in cooking loss rate and drip loss rate of turbot fillets during under refrigerated and ice storage

2.3 冷藏和冰藏條件下大菱鲆魚片質構特性的變化

冰藏和冷藏條件下大菱鲆魚片質構特性的變化如表2所示。隨著貯藏時間的延長，2組樣品的硬度、彈性和內聚性均呈顯著下降趨勢(P<0.05)。新鮮大菱鲆魚片的硬度、內聚性和彈性分別為4 995.25 g、0.728和0.847，冷藏組在貯藏到第10天時分別降至4 374.68 g、0.573和0.732，而冰藏組在貯藏第14天時分別降至4 414.67 g、0.766和0.603。咀嚼性是一項綜合評價指標，是肌肉的硬度、內聚性、彈性等共同作用的結果[24]。由表2可知，2組樣品的咀嚼性均隨儲藏時間的延長而逐漸下降，其中冷藏組樣品的咀嚼性下降更快，貯藏10天后，魚肉咀嚼性從初始的484.16下降至349.67，降低了27.78%，而冰藏組在貯藏第10 d時，魚肉咀嚼性為379.45，降低了21.63%，貯藏14 d后，下降至359.79，較初始值降低了25.69%，表明0 ℃冰藏更利于大菱鲆魚肉質構品質的保持。這與王曉君等[23]研究0 ℃和4 ℃貯藏下大口鲇質構品質變化結果相似。

2.4 冷藏和冰藏條件下大菱鲆魚片羰基含量的變化

羰基(醛基和酮基等)是蛋白質氧化過程中產生的重要成分，被廣泛應用于評估蛋白質的氧化程度[25]。由圖3可以看出，隨著貯藏時間的延長，兩組樣品的羰基含量均呈增加的趨勢，表明在冷藏和冰藏過程中大菱鲆魚片蛋白質均發生了不同程度的氧化，并且隨貯藏時間越長，蛋白質氧化程度越嚴重。大菱鲆魚片羰基的初始含量為1.32 nmol/mg蛋白質，試驗開始2天羰基含量增加較緩慢，2 d后開始顯著上升，并且冷藏組羰基含量上升速度明顯快于冰藏組。表明冰藏能延緩魚肉蛋白質氧化，因為貯藏溫度越低，肌肉中的各類化學反應速度越慢，在一定程度上延緩了肌原纖維蛋白的氧化變性，同時低溫抑制微生物的生長和酶的活性，從而抑制蛋白質降解以及肽鍵斷裂，羰基含量上升速度減慢。LU等[26]研究發現貯藏過程中魚肉羰基含量逐漸增加，并且微凍組魚肉羰基含量的上升速度低于冷藏組。PASSI等[27]也發現在冰藏過程中魚肉羰基含量明顯升高。大菱鲆魚片羰基的整體變化趨勢與感官評價的趨勢相近，蛋白質氧化裂解會生成醛、酮類等揮發性物質，魚體氣味發生改變，進而影響感官評分。FENG等[28]研究發現，輻照處理牛肉中醛類和酮類揮發性物質的生成與蛋白質氧化顯著相關。徐永霞等[29]研究發現，冷藏過程中大菱鲆中醛類和酮類物質發生明顯改變。

表2 冷藏和冰藏條件下大菱鲆魚片質構特性的變化Table 2 Change in texture characteristics of turbot fillets during under refrigerated and ice storage

注：同列數據上標不同英文字母表示有顯著性差異(P<0.05)。

圖3 冷藏和冰藏條件下大菱鲆魚片羰基含量的變化Fig.3 Change in carbonyl content of turbot fillets during under refrigerated and ice storage

2.5 冷藏和冰藏條件下大菱鲆魚片總巰基和二硫鍵含量的變化

2個巰基脫氫可形成雙硫鍵，引起蛋白質分子間交聯、聚合，進而導致肌原纖維蛋白空間結構發生變化[30]。由圖4曲線圖可以看出，隨著貯藏時間的延長，冷藏和冰藏條件下大菱鲆魚片肌原纖維蛋白的總巰基含量呈現顯著下降趨勢(P<0.05)。冷藏組樣品和冰藏組樣品的巰基含量總體分別下降了33.13%和29.4%。由圖4柱形圖可以看出，2組樣品肌原纖維蛋白的二硫鍵含量隨著貯藏時間的延長而顯著上升(P<0.05)。研究表明，在低溫貯藏過程中，肌原纖維蛋白會發生構象變化，埋藏在分子內部的疏基暴露出來，進而氧化生成二硫鍵，從而導致總巰基含量減少、二硫鍵含量上升[31]。由圖4還可以看出，冷藏大菱鲆魚片巰基含量的下降速率以及二硫鍵的升高速率明顯快于冰藏組。因此，冰藏處理比冷藏處理更好地保護蛋白質免受氧化變性。研究表明蛋白質氧化生成二硫鍵等蛋白交聯化合物，會強化肌原纖維蛋白的結構，對肉的硬度和嫩度都具有重要的影響[32-33]。

A-冷藏組巰基含量；B-冰藏組巰基含量；C-冰藏組二硫鍵含量；D-冷藏組二硫鍵含量圖4 冷藏和冰藏條件下大菱鲆魚片總巰基含量和二硫鍵含量的變化Fig.4 Change in total sulfhydryl content and disulfide content of turbot fillets during under refrigerated and ice storage

2.6 冷藏和冰藏條件下大菱鲆魚片表面疏水性的變化

蛋白質的表面疏水性反映的是蛋白質分子表面疏水性氨基酸的相對含量，可以用來反映蛋白質分子構象變化情況。由圖5可知，隨著貯藏時間的延長，冰藏和冷藏條件下大菱鲆魚片肌原纖維蛋白的表面疏水性均呈上升趨勢。這可能是因為貯藏過程中魚肉肌原纖維蛋白發生氧化變性，蛋白分子逐漸伸展，空間構象改變，親水基團和疏水基團的相對位置發生改變，疏水性脂肪族和芳香族氨基酸殘基暴露出來，從而導致蛋白質疏水性增加[34]。由圖5還可以看出，冷藏組前6 d及冰藏組前8 d肌原纖維蛋白的表面疏水性快速升高，之后緩慢上升，這可能是因為肌原纖維蛋白表面疏水基團在疏水相互作用下發生了蛋白質聚集[35]。

圖5 冷藏和冰藏條件下大菱鲆魚片表面疏水性的變化Fig.5 Change in surface hydrophobicity of turbot fillets during under refrigerated and ice storage

此外，在相同的貯藏時間內，冰藏組樣品肌原纖維蛋白的表面疏水性低于冷藏組，表明冰藏更有利于保持肌原纖維蛋白的空間結構。大菱鲆魚片表面疏水整體變化趨勢與蒸煮損失率和滴水損失率的趨勢相近，TRAORE等[36]研究發現豬肉蛋白質氧化與滴水損失存在相關性，表明蛋白質氧化能夠引起肉持水性的下降。

2.7 相關性分析

冷藏和冰藏過程中大菱鲆魚片蛋白質氧化和品質指標間的相關性如表3和表4所示，由表中可以看出，4 ℃冷藏條件下，除二硫鍵含量外，大菱鲆魚肉蛋白質氧化指標與感官評分之間顯著線性相關(P<0.05)。魚肉蛋白質氧化指標均與滴水損失率、硬度和咀嚼性顯著相關(P<0.05)，與蒸煮損失率極顯著相關(P<0.01)。0 ℃冰藏條件下，大菱鲆魚肉蛋白質氧化指標均與感官評分和持水性指標(滴水損失率和蒸煮損失率)之間顯著性相關(P<0.05)。對于質構而言，大菱鲆魚肉蛋白質氧化指標均與硬度極顯著相關(P<0.01)，與彈性和咀嚼性顯著相關(P<0.05)。另外，除總巰基含量外，魚肉內聚性與其他蛋白質氧化指標顯著相關(P<0.05)。總體來說在冷藏和冰藏條件下，大菱鲆魚片蛋白質氧化與感官評分、持水性以及質構特性之間存在良好的線性相關性。

表3 冷藏條件下大菱鲆魚片蛋白質氧化與品質指標的相關性分析Table 3 Correlation between protein oxidation and quality indicators of turbot fillets under refrigerated storage

注：*表示顯著相關(P<0.05)；**表示極顯著相關(P<0.01)。下同。

3 結論

隨著貯藏時間的延長，冷藏和冰藏條件下大菱鲆魚肉均發生了蛋白質氧化，同時魚肉品質逐漸劣化，并且貯藏溫度越低，大菱鲆肌肉蛋白質氧化程度越低，魚肉品質保持得越好，相關性分析表明在冷藏和冰藏條件下大菱鲆魚肉各項品質指標與蛋白質氧化指標均存在良好的線性相關性。顯示貯藏過程中大菱鲆魚肉品質變化與蛋白質氧化密切相關，但蛋白質氧化對魚肉品質變化的作用機理以及實際加工過程中蛋白質氧化控制利用技術還需要進一步深入研究。

表4 冰藏條件下大菱鲆魚片蛋白質氧化與品質指標的相關性分析Table 4 Correlation between protein oxidation and quality indicators of turbot fillets under ice storage